Research scientist Aafke Robben past met de door Da Vinci Laboratory Solutions ontwikkelde GC-Fractionator geautomatiseerde tweedimensionale preparatieve GC toe om in zeer lage concentraties aanwezige sensorisch interessante vluchtige componenten op te werken en te isoleren tot voldoende grote hoeveelheden voor structuuranalyse met NMR.
Misschien wel de meest uitdagende preparatieveGC-applicatie in Nederland is te bewonderen in het analytisch laboratorium van IFF in Tilburg. Research scientist AafkeRobben past daar geautomatiseerde tweedimensionale preparatieve GC toe om in zeer lage concentraties aanwezige sensorisch interessante vluchtige componenten uit grondstoffen te isoleren. Dit als voorbereiding voor bijvoorbeeld structuuranalyse met NMR of hoge resolutie MS. De toepassing binnen IFF is zo populair dat er inmiddels een wachtlijst is voor dit tijdsintensieve preparatieve GC-werk.
Honderden GC-injecties voor
1 mg geurcomponent
Vanuit IFF is veel interesse voor de nieuwe techniek. “We hebben hiervoor intern wat reclame gemaakt en dat had direct effect. Tientallen mensen binnen de organisatie hebben een monster voorgedragen. Die kunnen we natuurlijk niet allemaal direct van dienst zijn. We hebben het zo georganiseerd dat we samen met collega’s van R&D in Union Beach (VS) bepalen welke monsters voorrang krijgen. Vervolgens gaan we daarmee aan de slag. Als ons deel van het werk erop zit, sturen we de opgevangen fractie naar het analytisch lab in Union Beach waar aan de hand van NMR plus eventueel hoge resolutie MS de structuur wordt bepaald. Het geeft al veel voldoening als je dan hoort dat het gelukt is om de structuur op te helderen. Maar het summum wat dat betreft is dat een parfumeur bevestigt dat het synthetische product, dat op basis van die structuuranalyse is gemaakt, hetzelfde ruikt als de component die achter dat kleine piekje van het GC/MS-spectrum verscholen zat. Dat geeft echt een kick!”
Eer van je werk
Methode-ontwikkeling
Om het begin dit jaar geïnstalleerde 2D-systeem te optimaliseren voor het IFF-werk, heeft Aafke in eerste instantie veel tijd besteed aan het uitzoeken van de juiste flow en de juiste drukken, wat geen sinecure is als je met twee GC’s te maken hebt met allerlei split-stukken en een Deans-switch. De verschillende drukken op de kolom in combinatie met een vloeistofflow die er op het einde bijkomt en deels verdampt naar gas waardoor er een tegendruk ontstaat, maakt het geheel qua drukken heel complex. “Daar moet je ook weer de juiste diameters en lengtes aan capillairen bij zoeken. Je wilt namelijk niet dat de flow te hoog is, zodat je op de tweede kolom geen scheiding hebt. We zijn er in geslaagd om de drukken en flows min of meer te standaardiseren. Door wat te spelen met de verschillende parameters kun je per mengsel de scheiding optimaliseren”, licht Aafke toe.
Blik op het door Analytische R&D, PIA (Product Integrity Analysis) en Biodegradatie gedeelde lab van IFF in Tilburg, waar ruim twintig mensen werken.
Teamleider Joost Broekhans bij de eerste GC-Fractionator, die sinds 2018 in gebruik is bij het Analytische R&D-laboratorium van IFF in Tilburg.
Het GC-Fractionatie tool in de rechter Sampler Head vormt het hart van de automatisering van de tweedimensionale GC-Fractionator.
Maak in deze video kennis met het team en de chromatografie-oplossingen van Da Vinci
Je bent continu oplosmiddel aan het verdampen; het is wel zo fijn voor de medewerkers als dit direct wordt afgezogen,
Als analist of scientist werk je binnen een relatief klein team met een breed pakket aan technieken en applicaties.
Veel dynamiek binnen analytische R&D
Tilburg Analytical Services is één van de wereldwijde analytische R&D-labs van IFF. Het fysieke lab in Tilburg, waar ruim twintig mensen werken, wordt gedeeld door drie teams: Analytische R&D, PIA (Product Integrity Analysis) en Biodegradatie.
Analytische R&D heeft verschillende taken, legt teamleider Joost Broekhans uit. “Allereerst is dat het uitzoeken van nieuwe capabilities die binnen IFF kunnen worden toegepast: tools en technieken, oplossingen; hardware of software of een combinatie daarvan. De preparatieve GC is daar een goed voorbeeld van. Een andere tak is het geven van support aan productontwikkeling. Voor nieuwe producten die IFF op de markt wil brengen doen we ondersteuning met analyses. Om te begrijpen hoe bijvoorbeeld een geurstof in een shampoo zich gedraagt als je die onder de douche in je haar smeert, hoe de geur vrijkomt. Een derde is het maken van methodes voor de andere laboratoria binnen IFF, zoals PIA.”
Bij PIA worden grondstoffen gekeurd op ongewenste of gereguleerde bestanddelen, zoals bestrijdingsmiddelen, illegale kleurstoffen en weekmakers. Dat betreft vaak supergevoelige methodes en technieken, die bij Analytische R&D zijn ontwikkeld. “Het fysiek delen van het lab werkt heel efficiënt voor kennisuitwisseling. Als wij iets hebben ontwikkeld, kunnen wij het heel gemakkelijk overdragen naar de andere afdeling”, aldus Joost. Een derde team, dat er sinds een kleine twee jaar geleden is bijgekomen, is de afdeling die biodegradatie testen doet. Dat werk werd aanvankelijk uitbesteed, maar is mede door de focus op duurzaamheid zo groot geworden dat het interessanter is geworden om dat zelf te gaan doen.
Recent is IFF gefuseerd met de Nutrition & Bioscience divisie van DuPont, die sterk is in eiwitchemie. Hierdoor is het productenpallet van IFF verbreed. Dat brengt ook voor de analytische afdeling nieuwe werkzaamheden. “Voorheen deden we vooral vluchtige analyses, maar nu kijken we ook naar eiwitten. Dat is toch een heel andere expertise, inclusief de technieken die daarbij komen kijken. Die uitdaging gaan we graag aan met onze mensen, die met elkaar gemeen hebben dat ze enthousiast zijn over het vak. Daar selecteren we nieuwe medewerkers ook op; dat iemand niet helemaal de juiste kennis heeft vind ik minder belangrijk; dat leren ze wel. Sowieso ben je hier als analist of scientist binnen een relatief klein team met een superbreed pakket aan technieken en applicaties niet gebonden aan één techniek. Vroeg of laat krijg je de kans om met al die verschillende technieken te werken. Kijk wat dat betreft maar naar Aafke. Zij is in vier jaar tijd uitgegroeid tot specialist op GC-gebied, maar slaat haar vleugels al weer uit naar HPLC”, vertelt Joost enthousiast.
Waar voorheen een HPLC-pomp werd toegepast voor de dosering, is nu een kleine VICI Valco pomp gebruikt, die op de rail van het MPS-systeem is geklikt. Deze kan worden aangestuurd in hetzelfde softwareplatform, waardoor het systeem compacter is en ook gemakkelijker te besturen is. Ook wat betreft de software is er meer mogelijk. Zo kan je flexibeler de opvangtijden voor de fracties instellen.
Bij het nieuwe systeem is, net als bij het eerste, een door de technische dienst van IFF ontwikkelde afzuiging geïmplementeerd, die continu de lucht aanzuigt. Hiervoor is achter de trays een bak gemaakt met een sleuf erin. Die is gekoppeld aan de centrale afzuiging en werkt hetzelfde als de afzuiging bij fornuizen in moderne keukens. “Je bent continu oplosmiddel aan het verdampen; het is wel zo fijn voor de medewerkers als dit direct wordt afgezogen”, aldus Joost.
Waar je met ‘klassieke’ GC x GC alles dat van de eerste kolom komt in kleine stukjes op de tweede kolom injecteert, wordt in wat feitelijk een GC + GC applicatie is met behulp van een Deans-switch het interessante stuk eluens van de eerste GC drukgestuurd naar de tweede kolom geleid. Logistiek gezien is het nieuwe generatie MPS-systeem van GERSTEL nu uitgerust met twee, onafhankelijk van elkaar werkende armen (PAL’s), de ene voor de injectie van de monsters in de eerste GC en de andere voor de uiteindelijke fractionering. De transferline zit vast aan deze tweede arm, wat het tot een zeer robuuste constructie maakt. De overdracht van het geselecteerde eluens uit de eerste GC naar de tweede GC verloopt via een vaste, verwarmde transferline.
Omdat dit GC + GC systeem pas recent op de markt is gebracht, zijn er ten opzichte van het in 2018 ontwikkelde 1D-systeem verschillende innovaties doorgevoerd. Een belangrijke –zeker ook voor IFF– zijn in de GC’s ingebouwde sensoren die detecteren of er een lekkage is van het solvent dat wordt gedoseerd aan de GC. Als dat het geval is, dan schakelen ze het systeem direct uit.
Met de GC-Fractionator van IFF is inmiddels een veelvoud aan componenten in voldoende hoeveelheden opgevangen voor structuuranalyse met NMR. Het analytische wensenlijstje van IFF was hiermee echter nog niet volledig ingevuld. “Het lukt niet altijd om uit een natuurlijke olie van meer dan 200 componenten een geïsoleerde piek op te vangen, bijvoorbeeld door co-elutie. Ook niet na het proberen van verschillende analytische kolommen. Een zelfde verhaal is aan de orde bij het scheiden van enantiomeren in zuivere vorm”, vertelt teamleider Joost Broekhans.
Een oplossing hiervoor is gevonden in een tweede GC-Fractionator opstelling, die geconfigureerd is rond twee GC’s. Dat biedt verschillende voordelen ten opzichte van een enkele preparatieve GC. Op de eerste plaats kan het proces worden versneld door je bij de eerste GC op het gebied rondom één specifieke componentpiek te richten en de rest van het monster snel uit te stoken. Alleen het interessante stuk wordt op de tweede GC geïnjecteerd. In het verlengde hiervan kan je in principe ook hogere concentraties monster injecteren, omdat je de overbeladen pieken niet gebruikt voor de tweede GC. Omdat de scheiding in de eerste GC er niet zo mooi hoeft uit te zien, kan je het systeem wat meer overbeladen.
Omdat er twee GC-ovens zijn kan je ook twee verschillende kolommen inzetten. Je kunt dus ook orthogonaal scheiden (polair/a-polair) of er een chirale kolom in hangen, wat weer handig is bij het scheiden van enantiomeren. Pieken die co-elueren op de eerste kolom kunnen zo verder worden gescheiden op de tweede kolom. Dat grotere scheidend vermogen werkt twee kanten op: je kunt een grotere selectiviteit bereiken, maar ook het surplus aan scheidend vermogen niet gebruiken als dat niet nodig is, wat resulteert in een grotere snelheid.
Cruciaal voor preparatieve GC, zeker voor de toepassingen bij IFF, is automatisering. Nog niet zo lang geleden verzamelde je de fracties handmatig in een vaatje met oplosmiddel. Daar laat je het gas in bubbelen en met wat goede timing kan je dan een piek isoleren en opvangen. Deze benadering kost heel veel tijd, want je moet er letterlijk naast blijven staan. Bij de GC-Fractionator, waarbij je het ook nog een technisch gezien goed oplost door de vluchtige stof te condenseren, kan je die fracties automatisch opvangen.
De automatisering is door Da Vinci gebouwd rond een GC-Fractionatie tool, die er voor zorgt dat de transferline op bepaalde tijden na de GC-injectie boven de verschillende opvangflesjes hangt. De softwarematige besturing van de sampler zorgt ervoor dat bij herhaald injecteren iedere keer de betreffende component in hetzelfde flesje terechtkomt, zodat je een homogene fractie verkrijgt.
IFF heeft in 2018 geïnvesteerd in een eerste systeem voor preparatieve GC, de GC-Fractionator van Da Vinci Laboratory Solutions. Dit systeem is gebaseerd op een elegante, bij de VU-onderzoeksgroep Biomoleculaire Analyse van Jeroen Kool ontwikkelde methode, die is gebaseerd op een post-column infusie met een laag kokend oplosmiddel. Lees hier meer over de methode.
Het systeem bestaat uit twee delen: een GC en een LC-pomp. Nadat een monster is geïnjecteerd in de GC en is gescheiden in de capillaire kolom, wordt het effluent naar een 3-weg connector geleid. Deze splitst een klein deel van het monster naar de FID voor detectie; het overgrote deel gaat naar een tweede splitter voor fractionering. Hier wordt het draaggas met analyten uit de GC gemengd met een verdampt oplosmiddel –bijvoorbeeld hexaan– dat uit de LC-pomp komt. Dit mengsel condenseert vervolgens in een transferline die zich buiten de GC-oven bevindt. Doordat het mengsel condenseert, kunnen de fracties als vloeistof worden opgevangen in verschillende vials.
Om eenduidig de structuur aan de hand van NMR op te helderen van de verbindingen die achter die kleine piekjes schuilgaan, is tenminste 1 mg van de zuivere stof nodig. Dat kan je bereiken met behulp van een preparatieve scheidingstechniek, in dit geval preparatieve gaschromatografie. “Onze producten bevatten veel vluchtige componenten, die uitstekend gescheiden kunnen worden met GC. Het is daarom dat preparatieve GC in tegenstelling tot de veelgebruikte preparatieve LC veel uitdagender is voor ons om toe te passen. Dat zit hem vooral in het in de vloeistoffase opvangen van de vluchtige componenten, en dan ook nog eens netjes gecontroleerd in verschillende fracties”, vertelt research scientist Aafke Robben, die zich vanaf haar aanstelling bij Analytische R&D– ruim vier jaar geleden– toelegt op preparatieve GC.
Robuust en veilig
Sneller en selectiever
Dagen stampen
Geautomatiseerd
Elegant
Preparatieve GC
Om te illustreren hoeveel tijd het kan kosten om een component achter een klein piekje in voldoende hoeveelheden voor NMR-analyse te verkrijgen, heeft Aafke een rekenvoorbeeld uitgewerkt. “Stel we willen een component opvangen, die voor slechts 1% in een mengsel zit en we hebben daar minimaal 1 mg van nodig. We injecteren van dit mengselvoorbeeld 1 µl splitless van een 50% oplossing, wat neerkomt op 0,5 mg/µl mengsel dat per keer wordt geïnjecteerd. Het injectievolume is 1 µl, want het blijft wel een analytisch GC-systeem. Als we een hoger injectievolume gebruiken, kunnen we de componenten niet goed gescheiden krijgen op de analytische kolom. Je gaat niet hoger in monsterconcentratie, omdat dat de scheiding nadelig beïnvloedt; je wilt geen pieken overladen. De component waarin we geïnteresseerd zijn zit voor 1% in het mengsel en heeft een recovery van ongeveer 80%. Dit betekent dit dat we per run ongeveer 0,004 mg van de component kunnen opvangen. Voor 1 mg hebben we dus 250 injecties nodig. Als elke GC-run ongeveer 60 minuten duurt, hebben we zo’n 250 uur nodig om voldoende materiaal op te vangen voor een NMR-analyse. Dat is meer dan tien dagen 24/7 analyseren, dat gelukkig voor ons volledig automatisch plaatsvindt!”
Sinds 2014 wordt er bij IFF gewerkt aan het analytisch in kaart brengen van alle grondstoffen die door de geur- en smaakstoffenproducent worden gebruikt. Alle gedetailleerde informatie wordt opgeslagen in een database. Dit is een doorlopend project omdat er steeds nieuwe grondstoffen en leveranciers bijkomen, en omdat in de loop der tijd analytische technieken steeds gevoeliger zijn geworden. Hierdoor wordt de database steeds geüpdatet met nieuwe, meer gedetailleerde gegevens. Dat gebeurt vooral aan de hand van GC/MS, waarvan de spectra worden opgeslagen. Het streven is om elke piek te koppelen aan een structuur. Door zo minutieus de grondstoffen in kaart te brengen, kan je aan de hand van speciaal hiervoor ontwikkelde softwaretools gedetailleerd de samenstelling van bijvoorbeeld parfums achterhalen. Ook kan je ermee terugpuzzelen wat er aan grondstoffen nodig was om tot een bepaald product te komen. En kan je min of meer analytisch beredeneerd ook tot nieuwe of verbeterde producten komen.
Grote uitdaging voor dit werk is dat er binnen het brede palet aan IFF-grondstoffen zeer complexe natuurlijke oliën zitten, die wel meer dan 200 componenten kunnen bevatten. Daarbij kunnen de componenten die verantwoordelijk zijn voor de geur in extreem lage concentraties in het mengsel zitten; soms zo laag dat ze niet eens als piek in het GC/MS-spectrum zijn te zien. Daarbovenop komt dat deze verbindingen vaak als isomeren in het mengsel zitten, waarbij de ene isomere vorm de lekkere, voor het mengsel karakteristieke geur afgeeft, terwijl de andere reukloos is.