R&D operationeel manager Lotte Westerhof: "Verkijk je niet op de vele video’s op de sociale media van ‘kijk, ik kan zelf crisperen’. Dat kan dan misschien wel, maar het is een heel ander verhaal om de techniek zo toe te passen dat je er een deugdelijk product uit krijgt.”
Het Wageningse Hudson River Biotechnology (HRB) is in amper een jaar tijd gegroeid van zeven naar meer dan 50 medewerkers. Om alle scientists en analisten een goede werkplek te bieden zijn in sneltreinvaart de labfaciliteiten fors uitgebreid. Daarmee houdt het echter niet op, blijkt uit een gesprek met R&D operationeel manager Lotte Westerhof. Over een jaar zou wel eens een deel naar een ander gebouw moeten worden verhuisd om ruimte te bieden voor verdere groei.
Gloednieuw laboratorium Hudson River Biotechnology is al bijna weer te klein
Terry Rumpff maakt als analist deel uit van het planten tissue culture team, dat sinds begin dit jaar zijn intrek heeft genomen in het door Köttermann ingerichte laboratorium.
Kansrijke toepassingen voor nanodeeltjes
De eigenschap van de Plentrance nanodeeltjes dat ze materiaal over de celwand kunnen brengen is interessant voor meer toepassingen dan alleen het op zijn plek brengen van het RNP-complex. Je zou daarmee ook gewasbeschermingsmiddelen, meststoffen of triggers voor bloei in de cel kunnen afleveren. Dat kan dan heel precies en effectief met deze plantgebaseerde biodegradeerbare nanodeeltjes, zodat je bijvoorbeeld veel minder gewasbeschermingsmiddelen nodig hebt, wat minder belastend is voor het milieu.
Bij HBR zijn ze pas een klein jaar aan de slag met Plentrance en het bedrijf is naar zeggen van Lotte Westerhof aan de hand van proof-of-concept studies nog aan het ontdekken wat er allemaal mogelijk is. “Daar wordt nu vooral aan gewerkt in het biochemielab, maar het groeit zo snel dat er binnenkort ook een dedicated Plentrance afdeling zal zijn. Die zullen ook weer extra labruimte nodig hebben.”
Nieuw laboratorium
Routine en inzicht kenmerken ook de verdeling van de werkzaamheden van de teams die met de verschillende stappen van TiGER bezig zijn. Die bestaat grofweg voor de helft van de tijd uit het runnen van TiGER-projecten en voor de rest uit innoveren, wat deels binnen de projecten gebeurt en deels generiek. Om dat allemaal in goede banen te leiden is de labinfrastructuur al verschillende keren flink uitgebreid. “We zijn elders in het gebouw begonnen met een klein labje. Toen we meer labruimte wilden hebben, zijn we naar de andere kant van het gebouw gegaan, waar we nu zitten. Het lab was toen vier keer zo groot. Maar na een half jaar hadden we al door dat dat ook niet meer toereikend zou zijn. Zeker vanwege de wens om dedicated spots te hebben voor bepaalde werkzaamheden. Het steriele werk en het analytische werk: dat wil je niet mixen.”
Op de begane grond is op circa 500 m2 een nieuw laboratorium gerealiseerd voor al het steriele plantenwerk, dat erop gericht is om van één cel naar een plant te komen. In het regeneratieteam wordt uitgezocht hoe dat het beste gedaan kan worden; de grote planten tissue culture groep is hands-on met de plantjes bezig.
De LAF-kasten staan niet, zoals zo vaak, met de achterkant tegen de muur, maar zijn naar het midden van het lab gericht.
Op de begane grond heeft Hudson River Biotechnology 500 m2 nieuwe labruimte gerealiseerd, die is ingericht door Köttermann.
De LAF-kasten voor het steriele plantenwerk zijn zo geplaatst dat alleen de mensen, die aan de kasten werken, in dit deel van het lab komen.
Hoe meer routine we ontwikkelen en hoe meer inzicht we hebben in een bepaald gewas, kunnen we in theorie binnen een half jaar van één cel tot een plantje komen.
Elke cel in een plant kan in potentie weer terug naar de stamcelstatus en kan dan weer een hele plant vormen, dus dat hebben we mee.
Snel uitbreiden
Lotte is zeer te spreken over de snelle realisatie van het nieuwe laboratorium. “Die is mede door de flexibele en servicegerichte medewerking van Köttermann soepel verlopen. Voor ons was het de eerste keer dat we vanaf scratch een laboratorium hebben ingericht. We hebben met de medewerkers een plan gemaakt over waar we wat wilden hebben. Dat plan heeft onze labmanager Ester Dekkers met Köttermann kortgesloten, die vervolgens heel snel –binnen 12 weken– het meubilair heeft geïnstalleerd. Die snelheid was zeer gewenst, omdat we in die tijd veel nieuwe mensen hadden aangenomen, die we allemaal een volwaardige werkplek wilden geven.”
Momenteel is het relatief rustig op het P&O-front met betrekking tot de TiGER workflow. “Onze automation en innovation teams bekijken hoe we meer werk kunnen verzetten zonder dat we daar direct weer twintig nieuwe mensen voor moeten aannemen. Dat kan deels door automatisering en robotisering op het gebied van bijvoorbeeld liquid handling. Aan de andere kant, als alles verloopt zoals we denken, en we meer en vooral grotere opdrachten krijgen, dan lopen we ook met het nieuwe lab al weer snel tegen de grenzen van de groei aan en zullen we moeten uitkijken naar een ander gebouw. Gerede kans dat we dan ook weer Köttermann inschakelen voor het inrichten van de laboratoria.”
Rustige werkplek
Blikvangers in dit met Köttermann labmeubilair ingerichte lab is een hele rij LAF-kasten. Die staan niet, zoals zo vaak, met de achterkant tegen de muur, maar zijn naar het midden van het lab gericht. “Die kasten werken met hepa-filters en een luchtstroom. Om dat proces zo min mogelijk te verstoren hebben we de werkplekken aan de voorkant zo ingericht, dat daar alleen het dedicated personeel komt; iemand die er niets te zoeken heeft, komt er ook niet langs. Per werkplek is er een klein kastje waarin alle benodigdheden zijn opgeslagen, zodat je die in de buurt hebt en er geen extra verkeer is om dingen op te halen. Op ieder kastje ligt ook een tablet om alle experimentele details direct te kunnen documenteren in de elektronische labjournaal. Die hoort bij de werkplek”, vertelt Lotte.
Naast het grote lab is er een aparte ruimte met de klimaatkasten waarin de plantjes onder gecontroleerde licht- en temperatuurcondities groeien. Ook is er een via een sluis toegankelijk dierlijk labje dat met ML-2 een hoger beperkingsniveau heeft dan de rest van het lab (ML-1).
Het al langer bestaande lab op de eerste verdieping is nu volledig gericht op het genetische werk. Je vindt er de biochemici die aan de nanotechnologie werken en alle benodigde recombinante eiwitten produceren, waaronder het CRISPR enzym MAD7, en het team DNA-operations, dat DNA/RNA-isolaties uitvoert en sequenct om de exacte code en expressie van de relevante genen te achterhalen en de editing efficiëntie te bepalen. Het CRISPR-team werkt beneden aan het editen van de protoplasten.
Op de begane grond is op circa 500 m2 een nieuw laboratorium gerealiseerd voor al het steriele plantenwerk, dat erop gericht is om van één cel naar een plant te komen. In het regeneratieteam wordt uitgezocht hoe dat het beste gedaan kan worden; de grote planten tissue culture groep is hands-on met de plantjes bezig.
Snel en subtiel
Naast de voor de hand liggende klanten als breeders en zaadbedrijven van siergewassen en veld- en kasgroentes ziet HRB ook potentieel in onder meer de voedingsindustrie en bij producenten van farmaceutische producten in planten. “We zijn nu nog vooral bezig met laaghangend fruit om de technologie goed in de vingers te krijgen. Van veel gewassen weten we bijvoorbeeld dat bepaalde genen resistentie geven als ze er wel of juist niet zijn. Daar wordt op gekruist, maar dan moet je er ook voor zorgen dat een heleboel andere eigenschappen mee komen. Als je net die ene belangrijke mist kan je weer opnieuw beginnen. Wij kunnen dan met CRISPR die ene ‘er even’ bij zetten”, vertelt Lotte. En daarop voortbordurend: “Hoe meer je leert, hoe meer markers je erin wil hebben. Uiteindelijk krijg je hetzelfde product als je dat met kruisen doet. Veel eigenschappen zijn echter aan elkaar gelinkt. Dingen die alleen maar met elkaar overerven. Die kunnen we nu loskoppelen. Aan de andere kant kunnen we de variatie beperkter houden dan met traditionele methoden. Het is subtieler; je kruist er niet per ongeluk ‘wild type’ eigenschappen in.”
Maar het gaat vooral veel sneller. “De tijd die we nodig hebben om van één cel naar één plantje te komen is nu nog 1 tot 1,5 jaar, wat al veel sneller is dan de minimaal acht jaar die er staat voor kruisen. Hoe meer routine we ontwikkelen en hoe meer inzicht we hebben in een bepaald gewas, kan dat in theorie naar een half jaar!”
Perfect match
Ook wat betreft de guide is er nog winst te behalen. “In theorie kan je elke plek raken in het genoom, maar in de praktijk is dat niet zo. Dat kan aan de guide liggen. Die heeft een bepaalde structuur nodig om te associëren met het eiwit, waarbij het stuk dat aan het DNA moet plakken nog vrij moet zijn. Dat is niet altijd het geval. Of het stukje dat je wil raken is niet goed bereikbaar. Het zit bijvoorbeeld teveel opgevouwen, of het DNA is er gemethyleerd. Met onze guide design software kunnen we voorspellen hoe de interacties zijn met de guide, zodat die nog een goed complex met het eiwit kan vormen. Daarnaast doen we veel onderzoek zodat we in de toekomst de bereikbaarheid van DNA-locaties kunnen voorspellen dan wel aanpassen” Overigens maakt HRB gebruik van het MAD7-eiwit, dat kwalitatief gelijkwaardig is aan het veel bekendere Cas9, maar qua licensing een stuk goedkoper is.
Per werkplek heeft Köttermann een klein kastje geleverd. Hierin worden alle werkbenodigdheden opgeslagen, zodat je die in de buurt hebt en er geen extra verkeer is om dingen op te halen.
Groot verschil met het crisperen van dierlijke cellen is dat je bij plantencellen te maken hebt met een moeilijk doordringbare celwand.
Vanuit genetisch onderzoek zijn er al heel veel planteigenschappen gekoppeld aan specifieke genen, al is dat nog steeds een fractie van alles wat er te ontdekken valt. Zo’n koppeling tussen gen en ‘trait’, zoals Lotte dat noemt, is echter niet zo eenvoudig te vertalen naar de praktijk. “Verreweg de meeste commerciële gewassen zijn polyploïde en hebben meer dan twee, soms wel acht allelen van één specifiek gen. Als je alleen een knipje maakt in het ene allel, dan nemen de andere het gewoon over. Je moet het dus zeer efficiënt en nauwgezet doen. Een ander verhaal vormen de complexe traits, waarvan we weten dat er een samenspraak is van verschillende genen (twee tot drie genen in het eenvoudige geval; een veelvoud daarvan in complexe traits) om die trait te krijgen. Dan moet je in feite met je CRISPR een potje mastermind spelen om er achter te komen welk van die knoppen aan moeten blijven staan, en welke uit moeten. Dat is echt hogeschool CRISPR-werk!”
Dat mastermind spelen gaat tegenwoordig ook met behulp van kunstmatige intelligentie. HRB is recent een samenwerking aangegaan met het Duitse bedrijf Computomics, dat AI gebruikt om uit te zoeken welke targets werken voor welke trait, en welke niet; welke meer kans van slagen heeft.
Een recente innovatie om het RNP-complex in de plantencel te krijgen zonder de celwand te verwijderen is met behulp van nanodeeltjes. In deze deeltjes, die onder de naam Plentrance zijn gepatenteerd, kan het RNP-complex worden ondergebracht. Zodra de deeltjes de celwand zijn gepasseerd vallen ze uit elkaar en kunnen de guide en het CRISPR-eiwit hun werk doen. Voordeel van deze benadering is dat de bewerkelijke, en voor de plantencel tamelijk stressvolle stap om eerst een protoplast te worden en dan weer te worden geregenereerd, kan worden overgeslagen.
Groot verschil met het crisperen van dierlijke cellen is dat je bij plantencellen te maken hebt met een moeilijk doordringbare celwand en dat je bij het knip- en plakwerk in de cel geen DNA inbrengt, omdat je immers op een niet-GMO manier moet werken. HRB heeft hiervoor binnen de TiGER workflow innovatieve oplossingen ontwikkeld.
“Om een plant te crisperen zonder transgenen zal je het RNP-complex –het CRISPR-eiwit met het guide-RNA, die zorgt dat het eiwit precies daar knipt en nergens anders– in de plantencel moeten krijgen zonder dat als DNA-construct te doen. Dat kan door de celwand weg te halen. We maken hiertoe van bladcellen protoplasten, wat feitelijk gewone plantencellen zijn, maar dan zonder celwand. Vervolgens brengen we het RNP-complex bij de protoplast. Die geven we een chemische behandeling om het membraan tijdelijk permeabel te maken, zodat het complex er in kan diffunderen. Dat eiwit, dat we zelf maken, heeft ook een signaaltje aan zich die door de plant wordt herkend, zodat het complex in de kern wordt gebracht. Vervolgens gaat hij scannen over het DNA totdat hij zijn target tegenkomt en maakt het eiwit er een knipje. Voordat de plant het DNA weer aan elkaar geplakt heeft zijn er meestal wel een paar nucleotiden verloren of er is er eentje ingezet. Resultaat is een in-del, een insertie of een deletie, die in de regel tot een knock-out van het betreffende gen leidt”, beschrijft Lotte globaal de workflow tot en met het knipwerk. “We gaan momenteel vooral voor die knock-outs. Je kunt ook templates aanleveren voor een extra stukje DNA, maar dan kom je met het GMO-verhaal in tier-2, wat minder gunstig is voor markttoelating.”
Voor HRB is de aanstaande versoepeling in de regelgeving uiteraard ook goed nieuws, al is het bedrijf nu al superdruk met opdrachten. “Veel van onze klanten willen de technologie klaar hebben staan voor hun producten op het moment dat de restricties worden losgelaten. Ze hebben vaak niet de kennis en faciliteiten in huis om dat zelf te doen en zoeken daarvoor ondersteuning. Verkijk je wat dat betreft niet op de vele video’s op de sociale media van ‘kijk, ik kan zelf crisperen’. Dat kan dan misschien wel, maar het is een heel ander verhaal om de techniek zo toe te passen dat je er een deugdelijk product uit krijgt. Het is absoluut geen gemakkelijk trucje, zeker niet voor plantencellen. En dat blijft voorlopig nog wel zo”, aldus Lotte.
HRB ziet zichzelf niet als een dedicated CRISPR-bedrijf in de trant van de vele DNA-servicebedrijven, maar profileert zich als technology provider. “We innoveren continu om met de technologie mee te gaan, zodat we altijd aan onze klanten –de breeders en zaadbedrijven– de nieuwste technologie kunnen aanbieden. Dat is een hele complexe technologie die nog lang niet uitontwikkeld is en ook niet standaard kan worden toegepast. Voor ieder gewas, iedere eigenschap die je wilt inbouwen tunen we de oplossing. Dat aan de knoppen draaien beheersen we steeds beter met onze TiGER workflow.”
“Onder die tier 1-edits vallen ook de mutaties die we bij HBR aan de hand van CRISPR-technologie aanbrengen. Dat betekent een enorme boost voor bedrijven die deze technologie willen toepassen om tot verbeterde gewassen te komen. Ze kunnen hiermee versneld komen tot gewassen met eigenschappen als grotere opbrengst en/of voedingswaarde, resistentie tegen ziektes, betere bestandbaarheid tegen ongunstige klimaatomstandigheden en betere houdbaarheid. Zo hebben ambitieuze duurzaamheidsdoelen van bijvoorbeeld de Green Deal en Farm to Fork Fork initiatieven meer kans van slagen. En meer generiek: als we met de huidige landbouwmethoden doorgaan dan lopen we op een gegeven moment vast, want dan is er niet voldoende areaal om gewassen te verbouwen voor het voeden van alle mensen. Dus je moet sneller en beter gewassen verbeteren. Dat lukt niet met de klassieke manier van veredeling”, vertelt Lotte Westerhof, R&D operationeel manager bij Hudson River Biotechnology.
Effectief
Nanodeeltjes
Regenereren
Dealen met de celwand
Effectief crisperen
Boost
Na het editen van de cel moet daar weer een plantje van worden gemaakt. Ook dat vergt veel expertise. “Elke cel in een plant kan in potentie weer terug naar de stamcelstatus en kan dan weer een hele plant vormen, dus dat hebben we mee. Maar hoe zorg je er voor dat de bladcel weer teruggaat naar zijn ongedifferentieerde status en gaat delen? En hoe trigger je dat er op een gegeven moment weer organen ontstaan? Voor elke plant moeten we uitzoeken welke signalen er precies nodig zijn om dat te laten gebeuren. Dat is heel bewerkelijk.”
Hudson River Biotechnology (HRB) werkt met CRISPR-technologie aan meer dan vijftien verschillende gewassen. Deze technologie maakt het mogelijk om het breedingproces te versnellen van zo’n acht tot tien jaar naar slechts twee tot vier jaar. Dat is uiteraard voor plantenkweek- en zaadbedrijven een uitkomst. Omdat verbeterde gewassen sneller op de markt kunnen komen heeft dat ook een positieve impact op het veilig stellen van de wereldwijde voedselzekerheid.
Extra steun in de rug komt van de EU, die naar verwachting ergens in de komende jaren met regelgeving komt die minder star omgaat met genetische modificatie in planten en gewassen. Hierbij zou kunnen worden uitgegaan van een reguleringsmodel met drie niveaus voor de mate van modificatie en de te doorlopen procedures voor toetsing door de overheden. Tier-3 aanvragen, waarbij een transgen van een ander organisme wordt gebruikt, wordt volgens de huidige strenge richtlijnen beoordeeld. Bij tier-2 gaat dat toelatingsproces een stuk minder ver. Het gaat daarbij om het aanbrengen van genetische modificaties van dezelfde of een verwante soort. Voor tier-1 is zelfs geen toestemming nodig; je hoeft het alleen maar te melden. Hierbij gaat het om mutaties die ook spontaan in de natuur kunnen voorkomen.