Peptides synthetiseren

Net zoals met de investering in de HT12 een voorschot is genomen op meer peptide-onderzoek zou Nathaniel ook wel wat meer pro-actief gedrag willen zien ten aanzien van de ramp die ons te wachten staat vanwege antibioticaresistentie. “Investeer nu een paar miljard in antibiotica-onderzoek, dan besparen we over 30 jaar honderden miljarden. Maar ja, zo denken mensen niet, en dus ook regeringen niet. We kunnen niet veel meer doen dan ons best blijven doen om met ons fundamentele werk zo goed als mogelijk door te pakken, nieuwe mechanismen en kandidaten te ontwikkelen en te identificeren voor nieuwe antibiotica. Om die door de industrie te laten ontwikkelen tot medicijnen als de alarmbellen echt afgaan.”

Peptides synthetiseren

Sinds de oprichting van de groep ‘biologische chemie’–in 2018– maken de peptidechemici gebruik van de Liberty Blue van CEM voor het geautomatiseerd synthetiseren van peptiden, van veelal tien tot twintig aminozuren lang. Dit door BioSPX geleverde apparaat heeft ruim een jaar later gezelschap gekregen van de Liberty HT12, waarmee tot twaalf peptides tegelijk volledig automatisch kunnen worden gesynthetiseerd.

“We hebben voor deze apparaten gekozen vanwege de snelheid, het bedieningsgemak en het lage gebruik aan oplosmiddelen. Die snelle synthese zit hem in de microwave-technologie, die het mogelijk maakt om in een cyclustijd van vier minuten een aminozuur te koppelen aan de peptidestring. Dat scheelt behoorlijk in vergelijking met meer traditionele technieken waar dat zo een uur tot anderhalf uur kost. Met een peptide van twintig aminozuren ben je dan een hele dag zoet, terwijl onze apparaten er iets meer dan een uur over doen. Dat zet wel zoden aan de dijk bij experimenten waarvoor je tientallen verschillende aminozuren moet synthetiseren en/of grotere hoeveelheden wil hebben”, stelt Nathaniel.
Met de HT12 kan nog meer productie worden gedraaid, wat een uitkomst is om pieken in het gebruik op te vangen. “Inmiddels voert ongeveer de helft van de groep peptidegerelateerd onderzoek uit. De PhD’s en post-doc’s maken zelf hun peptides. Dat leren ze van mensen met meer ervaring, de master-users. Het is door de straightforward bediening ook niet echt moeilijk. Als je veel peptides hebt gemaakt voor je onderzoek, dan ben je automatisch master-user!”

Een derde optie om bacteriën beentje te lichten voordat ze door hebben wat er gebeurt (en dus veel minder mogelijkheden hebben om resistentie te ontwikkelen) is door de hulp van peptiden in te schakelen. Peptiden worden niet veelvuldig toegepast in medicijnen, met een grote uitzondering: antibiotica! Dat komt omdat peptidegebaseerde antibiotica sterk gemodificeerd zijn ten opzichte van het natuurlijke voorkomen en derhalve niet vatbaar zijn voor afbraak in het lichaam. Bovendien zijn antibiotica zeer selectief voor bacteriecellen. De targets die in de afgelopen jaren in bacteriecellen zijn gevonden, zijn dan ook uniek voor die cellen, en kunnen in veel gevallen worden aangevallen met peptidegebaseerde geneesmiddelen.

Een bijzonder uitdagende klasse van bacteriën zijn de zogenaamde Gram-negatieve bacteriën. Deze bacteriën hebben om de celwand nog een membraan zitten, dat niet alleen de kleuring blokkeert (daarom heten ze Gram-negatief), maar ook verhindert dat antibiotica op de celwand kunnen inwerken. Bij Gram-positieve lukt dat namelijk wel voor antibiotica als penicillines en cyclosporine, die de bacterie verhinderen om de celwand te maken, waarop ze fragiel worden en eenvoudig kunnen worden vernietigd.

“Sommige peptides maken gaten in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën. Die kan je linken aan een antibioticum, dat er normaal niet doorheen kan. Vorig jaar heeft Charlotte Wesseling, die bij onze groep haar promotie-onderzoek verricht, hierover gepubliceerd. Op basis van in de literatuur gevonden lichaamseigen peptides die binden aan het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën, heeft zij een kleine 40 unieke varianten gesynthetiseerd, die lijken op de natuurlijke varianten. Deze combineerde zij met antibiotica, die in hun eentje het buitenmembraan er niet onder krijgen. Maar bepaalde combinaties van deze hybride moleculen lukte dat wel!”, vertelt Nathaniel enthousiast.

Een ander peptideproject is gebaseerd op zo’n drie jaar geleden door een groep in Hongkong ontdekte peptide-antibiotica, die goed werkten. “Zij hadden dit geïsoleerd uit een bacterie, maar ze konden er niet veel van isoleren, minder dan een mg van 1 liter gefermenteerde bacteriën. Wij konden op basis van de structuur niet alleen dit ene peptide in gramhoeveelheden maken, maar ook gecontroleerd aangepaste versies van dat molecuul maken door kleine delen van de structuur te veranderen. Sommige daarvan bleken ook antibacteriële activiteit te hebben, zowel in vitro als in diermodellen.Dat zijn zeer bemoedigende resultaten voor de ontwikkeling van nieuwe klassen van antibiotica.”

Peptides

Om multidrug resistentie voor te blijven is het zaak om steeds nieuwe antibiotica te ontwikkelen, en dan vooral antibiotica die via nieuwe, voor de bacterie onbekende mechanismen te werk gaan. In dat geval hebben ze een veel kleinere kans om er resistentie tegen te ontwikkelen. “Het probleem is dat we wat dat betreft een beetje achterover zijn gaan leunen. In de vijftiger en zestiger jaren van de vorige eeuw is het laaghangende fruit geplukt, veelal antibiotica uit bodembacteriën. Wat eigenlijk heel vreemd is, want waarom zouden bacteriën, die leven in de bodem, een antibioticum produceren dat werkt in het menselijke lichaam? Je zou dus kunnen stellen dat we in die tijden gewoon veel geluk hadden, zeker omdat ook onze natuurlijke afweer met wapens als lage pH’s en allerhande enzymen er geen vat op heeft.”

Dezelfde passiviteit die er toe heeft geleid dat er momenteel te weinig nieuwe antibiotica met onderscheidende werkingsmechanismen worden ontwikkeld, kan je ook als een zegen interpreteren voor de mogelijkheden die er nog braak liggen om de bacteriën steeds een stapje voor te kunnen blijven. “De antibiotica die worden gemaakt door bodembacteriën zijn geoptimaliseerd voor hun werking in de bodem, zeker niet voor hun werking in het menselijk lichaam. Dat schept ruimte om op basis van chemische modificatie versies 2.0 van de natuurlijke antibiotica te produceren, die veel beter werken in ons lichaam, tot wel duizenden keren zo potent zijn. Zo zijn we er binnen onze groep in geslaagd om door enkele kleine structurele aanpassingen van het veelgebruikte vancomycine, waartegen de resistentie sterk aan het toenemen is, de activiteit met een factor 10.000 te vergroten, terwijl de toxiciteit niet toenam. Je hebt dus veel minder nodig voor hetzelfde effect. We hebben ook de ontwikkeling van resistentie onderzocht. Dat vonden we niet, dus dat is goed. Bovendien werkt het ook tegen vancomycine-resistente bacteriën!”

“Ook kan je met een frisse blik kijken naar de moleculen die wel antibiotica-activiteit lieten zien op een 96-wells plaat in het laboratorium, maar bijvoorbeeld toxisch bleken te zijn. Met onze toegenomen kennis over de werkingsmechanismen en toxiciteit kan je ook daar mee aan de slag. We kunnen bijvoorbeeld de structuur zodanig modificeren dat de activiteit tenminste behouden blijft en de toxiciteit afneemt”, legt Nathaniel uit.

Verbeteren van antibiotica

Met resistentie op zich valt nog wel te dealen. Ieder type antibioticum (er zijn circa twintig hoofdklassen) heeft zijn eigen methode/mechanisme om bacteriën te doden. En er is dus ook een resistentiemechanisme dat specifiek tegen een bepaalde klasse van antibiotica werkt. Als je resistentie hebt tegen antibioticum A hebt, kan je B gebruiken, of C, enzovoorts. Het echte probleem ontstaat bij multidrug resistentie, wanneer de pot met alternatieven (bijna) leeg is. Dat zie je vandaag de dag op verschillende niveaus gebeuren. In Westerse, goed geoutilleerde ziekenhuizen waar bacteriën opduiken die tegen 19 van de 20 beschikbare typen antibiotica resistent zijn. Maar ook in minder goed ontwikkelde zorgsystemen, waar er maar drie of vier verschillende antibiotica voorhanden zijn. “Dat heeft als gevolg dat we bepaalde infecties veel minder goed kunnen behandelen dan 30 jaar geleden. Iets wat je ook terugziet in de actuele sterftecijfers. In de Verenigde Staten en Europa zijn er een kleine 30.000 sterfgevallen per jaar die met antibioticaresistentie kunnen worden geassocieerd; wereldwijd zijn het er al meer dan 700.000”, stipt Nathaniel aan.

Multidrug resistentie

Met de door BioSPX geleverde Liberty Blue en twaalfkanaals Liberty HT12 apparaten van CEM worden jaarlijks honderden peptides gesynthetiseerd, ook voor kwantitatieve doeleinden.

Ook qua analytische apparatuur is de onderzoeksgroep rijk uitgerust.

“Resistentie is een natuurlijk fenomeen, dat hoort bij bacteriën. Zo lang als er bacteriën zijn, produceren ze antibiotica om zichzelf te beschermen. En dan is het wel zo handig als je resistent bent tegen je eigen antibioticum. Evolutionair gezien is die wisselwerking tussen de verschillende bacteriën genetisch gezien altijd in balans geweest. Totdat zo’n honderd jaar geleden de mens antibiotica, die van nature door bacteriën en fungi worden gemaakt, massaal begon te produceren voor de behandeling van infecties. Dat werkte uitstekend en heeft honderden miljoenen levens gered. Maar dit leidde ook tot een sterke evolutionaire druk op bacteriën om zich sneller aan te passen, door resistentiegenen van andere bacteriën te verkrijgen of door ‘spontaan’ resistent te worden. Als ze dat namelijk niet zouden doen, zouden ze doodgaan. Feitelijk heeft grootschalige toepassing van antibiotica in medicijnen bacteriën gedwongen om steeds meer uit de kast te halen om zichzelf te beschermen. Omdat ze zichzelf razendsnel reproduceren zijn ze heel goed in het ontwikkelen van mutaties, die resistentie faciliteren”, beschrijft Nathaniel de huidige wapenwedloop tussen mens en bacterie.

Uit balans

Tien miljoen doden per jaar ten gevolge van niet te behandelen bacteriële infecties. Dat is nog meer dan wat de verschillende varianten van het SARS-CoV-2 virus in ruim twee jaar tijd hebben teweeggebracht. Die tien miljoen is echter nog een ver-van-mijn-bed show. Op twee fronten. Ten eerste zal dat pas in 2050 het geval zijn. Ten tweede zal –hoe cynisch gesteld ook– het gros van de slachtoffers in de niet-Westerse wereld te betreuren zijn. Tel daarbij op de politieke opportuniteit van snel scoren en vooral niet te ver vooruit willen kijken. En vlak ook de rol van de farma-industrie niet uit, die zich vooral richt op therapeutische gebieden waar veel geld te verdienen is.

Temidden van dit voor het antibiotica-onderzoek niet bijster meewerkende krachtenveld is het een verademing om een uurtje met Nathaniel Martin om de tafel te zitten. Hij weet enthousiast te vertellen over de ontwikkeling van moleculen die aangrijpen in de resistentiemechanismen van bacteriën, het slim modificeren van bestaande antibiotica tot veel effectievere bacteriekillers en het construeren van hybride moleculen om dat vervelende buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën te slechten. Allemaal onderzoek dat plaatsvindt binnen de groep ‘biologische chemie’ in het Sylvius Laboratorium. Daarbij heeft hij ook een constructieve visie –vrij naar het Netflix-model– over hoe de farmaceutische industrie kan worden opgepord om haar innovatiekracht ook ten gunstige van antibiotica in te zetten (zie kader).