Jongleren met de tijd

Naast microscoopmanager is Livio Kleij ook labcoördinator. Binnen CMM Stratenum is de labcoördinatie verdeeld per verdieping. Livio neemt de tweede verdieping voor zijn rekening, een kleine 60 werkplekken. Zijn taken zijn gericht op faciliteren, zodat de mensen hun onderzoek zo goed mogelijk kunnen doen. Denk daarbij aan apparatuurbeheer, het regelen van aanpassingen in het lab en (kleine) verbouwingen, het doorzetten van benodigde reparaties naar de technische dienst van het ziekenhuis. Hierbij maakt hij net als bij de microscopen gebruik van het boekingssysteem, waarin ook een flowcytometer, biomolecular imagers en ultracentrifuges kunnen worden gereserveerd.

Omdat hij voor ieder van de onderzoekers aanspreekpunt is voor vragen en klachten, moet hij vaak flexibel omgaan met zijn werkplanning. “Ik begin de dag wel eens met een to-do lijstje, om er dan ’s-avonds achter te komen dat ik geen enkel item van het lijstje kan doorstrepen, maar wel druk ben geweest met van alles.” Bij dat van alles horen ook taken op het gebied van arbo & milieu, met speciale aandacht voor veiligheid en gevaarlijke stoffen.

Bekijk deze verzameling mooie plaatjes die door de verschillende onderzoeksgroepen binnen BioImaging zijn gemaakt

Data kunnen via het netwerk worden getransfereerd naar het server-park, waar ze veilig worden bewaard. Het is de bedoeling dat de lokale computer weer wordt vrijgemaakt voor de data van een volgende gebruiker. Dat is één van de punten op de checklist, die Livio bij zijn tweewekelijkse rondgang afvinkt. “In een soort van APK-light check ik ieder microscoopsysteem, of het nog schoon is, de lenzen okay zijn en niet beschadigd, of de output power van de laser nog goed is. Ook kijk ik naar de hoeveelheid data die op de microscoopcomputer staat. Onze policy is dat alles ouder dan twee weken wordt verwijderd. Maar ik check dan nog wel even bij de onderzoekers of ze echt weg kunnen. Daar zijn het te kostbare experimenten voor!”

APK-light

Eén van de meest recente aanwinsten is de Ti2-E confocale microscoop van Nikon, die is gekoppeld aan het W1 spinning disk systeem van Yokogawa. Dit complete door Nikon geleverde spinning disk confocale systeem is in eerste instantie aangeschaft om goed organoids met endogeen getagde fluorescente eiwitten in beeld te brengen. “Deze hebben een vrij lage expressie. Omdat ze ingebed zijn in de 3D-structuur en in de matrigel, heb je te maken met relatief veel background. In combinatie met dat toch al zwakke signaal resulteert dat in een ongunstige signaal-ruisverhouding. Aanvankelijk gingen we deze organoids te lijf met een widefield microscoop, maar zelfs door alles uit de kast te trekken met deconvolutie kregen we niet de gewenste S/N-ratio. Overstap naar een laser confocal leverde wel een goede S/N-ratio, omdat die een extra gevoelige detector heeft. Alleen is dat een puntscan-detector, waardoor de opbouw van een plaatje relatief lang duurt. En er zijn ook andere nadelen aan deze benadering gekoppeld; reden waarom we in 2019 bij Nikon de Ti2-E confocale microscoop hebben aangeschaft, met daaraan gekoppeld het W1 spinning disk systeem van Yokogawa.”

Nipkow-schijf

Met de spinning disk vang je vier vliegen in één klap. De verbeterde S/N-ratio vanwege de confocaliteit, snellere metingen, een meer optimale werkafstand en langer levende cellen, omdat ze geen last hebben van fototoxiciteit. De laatste drie voordelen zijn inherent aan het principe van de spinning disk, dat is gebaseerd op de Nipkow-schijf. In plaats van één enkele pinhole, zoals bij een laserscanning confocale microscoop, heeft een spinning disk confocale microscoop honderden pinholes die in spiralen zijn gerangschikt op een ondoorzichtige schijf die met hoge snelheid ronddraait. Wanneer de schijf ronddraait, scannen de pinholes in rijen over het monster, waardoor een beeld wordt opgebouwd. Het gebruik van een draaiende schijf verhoogt de imaging-snelheid en vermindert de lichtintensiteit qua exposuretijd waardoor er geen fototoxiciteit kan optreden ten gevolge van de sterke intensiteit op een en dezelfde plek.

De gaatjes in de schijf zijn zo aangebracht dat elk deel van het beeld gescand wordt terwijl de schijf ronddraait. Door de rotatiesnelheid van de schijf, de diameter van de gaatjes en/of de afstand tussen de gaatjes te wijzigen, kunnen de helderheid, het contrast en de kwaliteit van het beeld worden geoptimaliseerd. Een grotere diameter van de gaatjes leidt tot een betere lichttransmissie door de schijf, maar vermindert ook de resolutie. Een grote afstand tussen de gaatjes elimineert de overspraak tussen de gaatjes, maar vermindert ook de lichttransmissie. Kleine pinholes met grote tussenruimten resulteren in een hogere resolutie, maar een lagere lichttransmissie door de schijf.

Op die manier kan je tot een configuratie komen, die optimaal is afgestemd op de experimenten. In dit geval is niet gekozen voor de standaard X1 spinning disk module, maar de W1-versie, die een betere S/N-ratio heeft en een groter frame kan belichten, zodat je ook nog eens grotere plaatjes kunt maken. In één rotatie van de schijf kan je drie volledige frames opnemen, die plaatjes opleveren met een maximale resolutie van 2048 x 2048 pixels.

Spinning disk

Werkpaarden

Omdat je met de nieuwe opstelling in één keer veel meer data kan opnemen, is ook direct geïnvesteerd in een extra server. “Databeheer vormt een steeds belangrijker onderdeel binnen mijn takenpakket. In een beetje experiment kan zomaar 1,5 tot 2 TBytes aan data worden gegenereerd. Sommige experimenten, bijvoorbeeld voor onderzoek naar celadhesie, duren maar een paar uur. Maar om de dynamiek goed te volgen moet je daarvoor iedere minuut wel tien verschillende posities opnemen; dan kom je uit op al best veel plaatjes. In het geval van de experimenten met de spinning disk confocal wordt de ontwikkeling van een organoid over enkele dagen gevolgd door bijvoorbeeld om de tien minuten een plaatje te maken. Dan heb je het in het geval van een organoid over 60 tot 90 z-planes, minimaal twee kleuren, 10 tot 100 posities, 50 tot 300 tijdspunten. Dan tik je de terabytes wel aan!”

Geheugenvreters

In het microscooppark kom je alle bekende merken tegen. Die zijn verdeeld over verschillende types: laser scan confocal, spinning disk confocal, widefield met SIM (structural illumination microscopy), een soort van armeluis confocal volgen Livio, meer ‘huis-tuin-en-keuken’ microscopen als widefield voor timelapsers, screening microscopen, waar je hele scans mee kunt maken, en stereomicroscopie. “In het algemeen kan je stellen dat we weinig poes-pas systemen hebben, maar veeleer werkpaarden, waar mensen na een gedegen training goed mee uit de voeten kunnen om onderzoeksdata te produceren”, stelt Livio.

Livio heeft in zijn meer dan 25-jarige carrière als microscopist de verschuiving van 2D- naar 3D-microscopie volledig meegemaakt. “Tot voor 15 jaar geleden lag de focus nog op 2D-celstructuren als cellijnen. Vandaag de dag zijn het 3D-structuren als spheroids en organoids die de klok slaan. Die vereisen een andere imagingtechnologie. Bijvoorbeeld, de werkafstanden van objectieven moeten groter zijn, want anders kan je niet met de relatief grote 3D-structuren overweg; blijf je ergens halverwege hangen en kom je net niet bij het interessante deel; dat krijg je gewoon niet scherp. Daarbij komen zich alsmaar doorontwikkelende trends als sneller, meer high-throughput, gevoeliger. Dat wil iedereen, en dat kan ook. Technologie, ook die van de read-out systemen, de camera’s en de detectoren; alles wordt gevoeliger en sneller.”

Altijd langs Livio

Iedere nieuwe medewerker, of dat nu een master-student is die stage loopt, een PhD-student of een post-doc, krijgt een basistraining van enkele uren van Livio. Ook als ze elders al met een bepaald systeem hebben gewerkt. “Naast het in de oren knopen van de do’s en de don’t’s streef ik er naar dat ze na die training direct met een sample aan de slag kunnen gaan. Laat maar zien of je begrepen hebt wat ik net allemaal heb verteld. Dat zal niet meteen allemaal goed gaan. Maar ik merk wel snel wie er meer of minder gevoel bij de techniek heeft. Bij wie je dus later wat vaker langs moet lopen. Sowieso wordt het zeer gewaardeerd als je ze helpt bij het instellen van een systeem en adviseert over de beste imaging-strategie. Er is met 4-, 8-, 16- of 96-wells platen heel wat keuze aan inserts, die je allemaal moet instellen. Templates maken het leven wel wat makkelijker, maar je bent er toch zo een kleine twee uur mee zoet. Als alles klopt, is het go en heb je er verder weinig omkijken naar.”

Vanuit het boekingssysteem heeft Livio altijd inzicht in wie met welk systeem aan de slag is. Naast het efficiënt lokaliseren van de medewerkers bij wie hij graag een extra keer langs gaat, geeft het systeem ook waardevolle inzichten in het gebruik. “Ik zie in een oogopslag welke microscoop veel, en welke weinig wordt geboekt. Dat onderscheid heeft vaak te maken met de ouderdom van het instrument. Door de bank genomen wil iedereen altijd op het nieuwste microscoop-systeem. Dat is echter niet haalbaar. Het is dan ook mijn taak om met de onderzoeker in gesprek te gaan: wat wil je precies doen? Als dat prima op een relatief eenvoudige widefield-systeem kan, hoef je geen kostbare tijd te bezetten op een meer geavanceerd systeem. Waar iemand anders dan een experiment moet uitstellen voor een week of twee omdat ie er niet bij kan. Soms moet ik mij wel een beetje als een politieagent opstellen.”

Livio Kleij moet er altijd wel een beetje om lachen. Als hij een verschrikt hoofd ziet opduiken vanachter een van de tien microscoopopstellingen waarover hij de scepter zwaait. “Je ziet ze denken: ‘wat heb ik nu weer verkeerd gedaan?’. En als ik dan zeg dat ik even kom checken of alles naar wens verloopt, of ze nog vragen hebben, dan zie je die spanning direct plaatsmaken voor een opgeluchte glimlach: het is toch niet de boogeyman!”

Misschien wel de meest arbeidsintensieve werkzaamheden als microscoopmanager liggen in het informele circuit. Een rondje maken langs de microscopen, die verspreid staan over drie verdiepingen van het Stratenum-onderzoeksgebouw. En ook andersom, want de onderzoekers weten Livio altijd wel te vinden. Snel een praktische vraag oplossen die tijdens de experimenten op komen; een schuifje openzetten voor een betere lichtverdeling; de instellingen net iets aanpassen zodat de relevante delen van het organoid haarscherp in beeld komen. “Je kunt mij vergelijken met een katalysator. Ik maak het de onderzoekers gemakkelijker; zorg er voor dat ze sneller tot de optimale instellingen komen. Ze komen er op den duur zelf ook wel uit, maar ik los het veel sneller voor ze op; ken alle ins-and-outs van de systemen, weet precies hoe je iets in de software moet doen.”