Vanwege de uitbreiding van de onderzoekscapaciteit zijn extra syringe pompen besteld. “Hiermee kunnen analisten dan weer uit de voeten om nieuwe opstellingen in te richten en ermee aan de slag te gaan. Als je een beetje handig bent, het leuk vindt om met techniek om te gaan, kan je bij die doorstroomsystemen je ei goed kwijt. Je moet van alles aansluiten; slangetjes gaan alle kanten uit. Zo’n installatie vergt altijd aandacht: druppelt er nergens iets; is al het glaswerk adequaat gevuld? Ook moet je zelfstandig de pompen kunnen onderhouden, onderdelen vervangen, schoonmaken. Ook computertechnisch zijn er de nodige uitdagingen. Sowieso de integratie daarvan in het systeem, maar ook het instellen van de regelsoftware voor de pompen. En als ik dan zo vrij mag zijn om ons lab te vergelijken met andere meer ‘standaard’ labs, dan is er hier toch wel meer dynamiek en is het grondstoffelijker. We werken met visueel waarneembare organismen, die je letterlijk ziet groeien. Je moet wegen, meten, van alles volgen. En het is ook fysieker; je bent veel aan het lopen. Het is hier nooit saai!”

Nooit saai

Marcel Migchielsen schat in dat de eerste doorstroomsystemen al meer dan twintig jaar geleden zijn opgebouwd met de syringe pompen van Gilson. “Inmiddels zijn de pompen van het eerste uur vervangen door nieuwe modellen, vooral om preventieve redenen. Op een zeker moment worden deze als ‘out of life’ geclassificeerd door de leverancier en dan zijn er geen reserve-onderdelen meer beschikbaar. Dat risico willen we natuurlijk niet nemen, zodat we in nieuwe modellen hebben geïnvesteerd. Die passen overigens naadloos in de bestaande testopstellingen, want belangrijke onderdelen als kleppen en spuiten zijn nog exact hetzelfde.”

Hart van een doorstroomsysteem is een Verity syringe pomp van Gilson, die heel precies om de zoveel tijd een hoog geconcentreerde oplossing doseert. In een mengfles wordt deze oplossing met testmedium gemengd, waarbij de aanvoer van het medium met flowmeters wordt geregeld. Via een overloopsysteem komt dit mengsel dan weer in de bak waar de test plaatsvindt.

Het doseren komt heel nauw, en verschilt per te onderzoeken stof. De analist geeft in de software, die de syringe pomp aanstuurt, aan hoeveel en hoe vaak er moet worden gedoseerd. In de regel wordt er tussen de 30 µl en 200 µl per keer gedoseerd, zo’n vier tot twaalf keer per uur. Ook kan in de regelsoftware worden ingesteld hoe snel de injectiespuit op en neer moet gaan.

Het functioneren van de syringe pompen –per testopstelling kunnen dat er al snel tien tot twintig zijn– wordt continu gelogd. Op het moment dat een pomp hapert, kan de analist direct zien waar het probleem is. Ook gaat automatisch de klep dicht van de flowmeter, die het verdunwater aanvoert naar de mengfles waarop de betreffende syringe pomp is aangesloten. Als dat niet gebeurt, ga je te ver verdunnen en wordt de test niet langer correct uitgevoerd.

Het bepalen van de juiste testaanpak begint bij informatie verzamelen: wat voor type stof is het, is er een analysecertificaat, is het zuiver, is het oplosbaar in water, is het stabiel in water? Op basis van een korte voortest wordt de strategie bepaald: lost de maximaal te testen concentratie van 100 mg/L op of juist niet, en hoe kunnen we dat dan aanpakken? Als er sprake is van een goede oplosbaarheid dan wordt door simpel te mixen/roeren de oplossing gemaakt, die vervolgens wordt doorverdund tot een aantal verschillende concentraties, die voor de finale test worden gebruikt. De lastigste situatie is een stof die bestaat uit een mengsel van meerdere componenten en die niet wil oplossen in water. Bij een dergelijke stof wordt elke testconcentratie apart aangemaakt vanwege bijna zekere onderlinge verschillen in oplosbaarheid van de individuele componenten. Daarnaast wordt dan de onopgeloste fractie verwijderd na afloop van de aanmaakprocedure (bijvoorbeeld door filtratie bij een poeder of overhevelen van de opgeloste fractie bij een drijvende olielaag) om te komen tot de maximaal opgeloste fractie per testconcentratie.

Dergelijke mengsels zijn overigens geen zeldzaamheid. “We krijgen producten in allerlei stadia van ontwikkeling. Daar kunnen ook reactormengsels tussen zitten. Of het zijn zogenaamde UVCB’s: ‘Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials’, in goed Nederlands: we weten niet precies wat het is en hoeveel er van in zit. Ook daar draaien we onze hand niet voor om!”

Voor de acute toxiciteitstesten wordt gestreefd naar testen tot en met 100 mg/L, de maximaal te testen concentraties volgens de betreffende richtlijnen. Haal je dat niet, wat door de aard van de stoffen vaak voorkomt, dan test je de maximaal opgeloste fractie. Daar kan ook weer een uitdaging in zitten richting de analytische kant. “De oplosbaarheid kan zo laag zijn dat je tot concentraties komt die in de buurt liggen, of soms zelfs lager zijn dan de detectielimiet van de apparatuur. Dat is een uitdaging voor onze collega’s van de analytische chemie waarmee we nauw samenwerken. Tijdens alle aquatische testen worden er analysemonsters genomen van de oplossingen om te meten wat de daadwerkelijke concentratie is. Dit is ook een eis uit de OECD-richtlijnen en de uiteindelijke effectwaarden moeten op deze resultaten worden gebaseerd. Voor een zinvol testresultaat is het zaak om die soms enkele nanogrammen per liter nog wel te kunnen meten. Je moet dan qua kennis en vaardigheden echt alles uit de kast halen om met een test te kunnen beginnen en deze met een betrouwbaar resultaat af te ronden.”

Waar het uitvoeren van in vivo protocollen al een extra dimensie geeft aan de werkzaamheden, zijn er chemisch gezien zeker ook de nodige praktische uitdagingen. “We testen in een aquatisch milieu en dan is het wel zo handig als de stoffen oplossen in water. Dat is echter vaak niet het geval. Het kan bijvoorbeeld gaan om een olieachtige vloeistof, of een pasta, een poeder. Ook kunnen er meerdere componenten in een testmonster zitten met verschillende eigenschappen zoals verschillen in oplosbaarheid en toxiciteit. Voor al die verschillende gevallen hebben we een arsenaal aan technieken en methoden om de stoffen zo goed mogelijk opgelost te krijgen. Denk daarbij aan ultrasonificatie om poeders te vergruizen zodat ze beter oplossen. De richtlijnen stellen: er mag geen onopgelost materiaal in de uiteindelijke testoplossing zitten, dus filtreren of centrifugeren om de onopgeloste fractie eruit te halen horen vaak ook bij dit zorgvuldige werk. De reden dat onopgelost materiaal niet aanwezig mag zijn is het feit dat dit kan leiden tot een fysisch effect op het organisme, waardoor de effecten niet meer alleen te wijten zijn aan de toxiciteit van de te testen stof. Het is aan de analist om samen met de studieleider de juiste keuzes te maken om een maximaal opgeloste fractie te krijgen en hier handigheid in te ontwikkelen. Hoe krijg je bijvoorbeeld een plakkende pasta nauwkeurig afgewogen en krijg je alles in je oplossing? Dat is geen sinecure”, vertelt Marcel enthousiast.

Bij ‘aquatische toxicologie’ –de afdeling van Marcel– wordt gekeken naar de effecten van in het waterige milieu opgeloste stoffen op organismen, zoals vissen, algen en watervlooien. Hiervoor worden vanuit de registrerende instanties allerlei testprotocollen voorgeschreven. Zo zijn er kortdurende testen waarin wordt bepaald bij welke concentratie de organismen sterven. In lange termijn studies kan worden getest of de organismen minder hard groeien of zich anders gaan gedragen als ze blootgesteld zijn aan een bepaalde concentratie. Ook wordt in een chronische setting de accumulatie van lage concentraties stoffen in vissen onderzocht. Een derde voorbeeld is de ‘early life stage’ test met vissen: je kijkt of bij bepaalde testconcentraties visseneitjes uitkomen en dan volg je nog 28 dagen de ontwikkeling van die visjes. Resultaten van alle studies worden vergeleken met een onbehandelde controlegroep om uiteindelijk te komen tot de benodigde effect-concentraties zoals de NOEC (No Observed Effect Concentration), maar ook waar nodig EC10, 20, 50 waarden (waar 10, 20 of 50% effect ten opzichte van de controle is gevonden).

De afdeling ‘aquatische toxicologie’ is met nog een tweede afdeling –‘biodegradatie en environmental fate’– onderdeel van de ‘ecotox’ groep, die binnen de wereldwijde CRL-organisatie een unieke plaats inneemt. “Waar je in vestigingen in tal van andere landen –net als in Den Bosch trouwens– test- en onderzoeksfaciliteiten op het gebied van humane toxicologie, fysische chemie, analytische chemie en genetische toxicologie hebt, houden wij ons met zo’n vijftien studieleiders en twintig analisten als enige binnen het gehele concern bezig met milieutoxicologie: oftewel: onderzoek naar het effect van een bepaalde stof op het milieu. Met een stof in het milieu kan van alles gebeuren, en dat wil je in het kader van een ERA (‘environmental risk assessment’) voor bijvoorbeeld een farmaceutisch product zo goed mogelijk in kaart brengen aan de hand van allerhande studies die door de OECD, de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, zijn vastgelegd. Zo kijken we bij ‘biodegradatie’ naar de afbraak van een stof in het milieu, waarbij we gebruik maken van bacteriën uit een waterzuivering. ‘Environmental fate’ studies gaan een stuk verder: wat gebeurt er met een stof als die in het milieu terechtkomt? Neem als voorbeeld een bestrijdingsmiddel dat op een akker wordt gespoten. Dat spoelt uit door de regen; waar gaat het dan naar toe, waar hecht het zich aan? Blijft het de originele stof? Wordt die ergens in het systeem omgezet door bijvoorbeeld bodembacteriën? Of is de stof fotosensitief en wordt die door licht afgebroken? Dat volgen van het milieupad moet niet alleen in registratiedossiers van bestrijdingsmiddelen worden gedocumenteerd, maar ook bij medicijnen, die immers via het toilet in het milieu terecht kunnen komen.”

Meer syringe pompen

Batterij aan dilutors

Stabiel houden

Zuiver of niet?

Praktisch uitdagend

Ecotox

Als je dan eenmaal geschikte oplossingen hebt kunnen maken is het zaak om de concentraties tijdens de testen, die tussen de 2 en 28 of meer dagen kunnen duren, zo constant mogelijk te houden. Dat is minder voor de hand liggend dan je zou denken. Bij hele lage concentraties kan adsorptie aan het glas van de experimenteerbakken voor significante afwijkingen zorgen. Ook kan een stof vluchtig zijn en verdampen uit water, lichtgevoelig zijn of afbreken in water. Door deze eigenschappen van tevoren in kaart te brengen kan je daarop anticiperen in de testopstelling. Bij een vluchtige stof kan je zorgen dat er geen of minimale headspace is in de testsystemen zodat de stof geen ruimte krijgt om te verdampen. Licht dimmen kan bij lichtgevoelige stoffen heel wat uitmaken (al moet je er ook rekening mee houden dat algen en vissen ook licht nodig hebben).

Afhankelijk van de mate van instabiliteit zijn er drie protocollen voor onder meer de testen met vissen en watervlooien. De standaard test is het meest recht door zee: je maakt de oplossing aan, doet het organisme erin en voert de test uit (statische blootstelling). De semi-statische test is al een stuk bewerkelijker. Hiervoor maak je iedere dag een verse oplossing en zet het organisme daarin over. Deze wordt toegepast als de concentratie over 1 dag minder dan 20% afneemt. Als de concentraties per dag met meer dan 20% afnemen, dan worden doorstroomsystemen, ook wel flow-through systemen genoemd, gebruikt. Hierbij wordt de oplossing continu ververst, zodat de concentratie opgeloste stof optimaal op peil blijft.

Wie een studie wil laten uitvoeren naar de korte termijn (acute) of lange termijn (chronische) effecten in het milieu van geneesmiddelen, industriële chemicaliën of gewasbeschermingsmiddelen zal wat geduld moeten betrachten. Een Contract Research Organisatie (CRO) als Charles River Laboratories (CRL) kan vandaag de dag dergelijke studies niet meer binnen heel korte termijn inplannen; bij andere CRO’s in het buitenland is er ook een beperkte onderzoekscapaciteit. Hiervoor zijn verschillende oorzaken aan te geven “Ten eerste is er sprake van een groeiende vraag; er worden veel nieuwe producten ontwikkeld en die moeten in het kader van wettelijk verplicht veiligheidsonderzoek voor mens en milieu in verschillende settings worden getest. Daar komt bij dat er vanuit de REACH-wetgeving nog steeds een flinke inhaalslag gaande is. Waar we enkele jaren geleden heel veel bestaande stoffen, die nooit eerder adequaat waren onderzocht op milieuveiligheid hebben getest (aceton was er zo eentje!) met korte termijn studies, zitten we nu in een tweede fase met veel uitgebreidere, langdurige en arbeidsintensieve testtrajecten. Daar komt bovenop dat het een hele uitdaging is om geschikt personeel te vinden voor al dat werk. Er komt namelijk heel wat kijken bij het ontwikkelen van een analytische methode en het uitvoeren van de studie. Hoe leuk, afwisselend en uitdagend ons werk ook is, we vissen net als andere bedrijven en kennisinstellingen in een niet al te volle vijver”, vertelt Marcel Migchielsen, afdelingsleider ‘aquatische toxicologie’ bij de CRL-vestiging in Den Bosch.