Stills uit live cell imaging experiment met de Lionheart, waarbij de L-vorm als ware het een Pac-Man via een endocytose-achtig mechanisme DNA opneemt. Bron: Kapteijn, R., Shitut, S., Aschmann, D. et al. Endocytosis-like DNA uptake by cell wall-deficient bacteria. Nat Commun 13, 5524 (2022).

Arranged marriage

Een zelfde soort ervaring had hij recentelijk met post-doc Tijn Delzenne, die een heel eigen draai aan de Pac-Man’s wist te geven. “Tijn had al ervaring met cyanobacteriën opgedaan. Dat zijn bacteriën die met behulp van licht energie kunnen genereren om bijvoorbeeld suikermoleculen te produceren. Zijn gedachte was: kunnen we niet eens proberen of we die bacteriën kunnen laten ‘engulfen’ door de L-vorm? En dan dusdanige voorwaarden scheppen dat ze in die L-vorm blijven groeien, waarbij er op een zeker moment een toestand van symbiose ontstaat, waarbij ze wel bij elkaar moeten blijven om te overleven. Als dat werkt, kan die cyanobacterie door middel van licht voedsel genereren voor de L-vorm. Analoog aan ander onderzoek, waarbij een cyano is ingebouwd in een gistcel, die vervolgens op licht kan groeien, zou je dan met antibioticaproducerende bacteriecellen celfabriekjes kunnen genereren die draaien op licht. Inmiddels heeft Tijn een elegant systeem ontwikkeld waarin we zo’n arranged marriage kunnen regelen. Daarmee staan we aan het begin van wat misschien over tien jaar echt in de procesbiotechnologie kan worden toegepast. Dat is toch fantastisch?”

Zelfsturend

Een voorbeeld van die katalyserende zelfmotivatie ziet Dennis bij Noortje Dannenberg, die werkt aan de celwandloze mycobacteriën bij tuberculose. “Zij stond in 2017 opeens in mijn kamer met de vraag of ze stage kon lopen. Dat was precies op het moment dat ik eraan dacht om met mycobacteriën te beginnen. Ik stelde dat voor, en daar had ze wel oren naar. Zij had zelf in Indonesië in een tuberculose-lab gewerkt. Die stage verliep prima, en op basis daarvan heeft ze haar eigen aanvraag voor een onderzoeksbeurs geschreven en is ze als aio aan de slag gegaan.”

Stimuleren

Als opleidingsdirecteur van de master-opleiding heeft Dennis samen met zijn collega Marcel Schaaf van de bachelor-opleiding tijdens de coronatijd een cursus ontwikkeld waarin studenten leren om onderzoeksvoorstellen te schrijven. “Het labwerk lag min of meer stil, dus je moest wat anders bieden. De cursus bleek goed aan te slaan bij de studenten; en het is ook heel leuk om ze te laten nadenken over wat ze met wetenschap willen bereiken. Dat stimuleer ik ook bij de onderzoekers binnen onze groep; dat ze meer het heft in eigen handen nemen. Ergens worden ze een keer geprikkeld. Dat vinden en faciliteren dat ze daar iets mee gaan doen geeft mooie, verrassende resultaten. Een promotie-onderzoek gaat vaak ook een heel andere kant op dan in de aanvraag is aangegeven. Dat is goed, want het volgt de interesse van de onderzoeker.”

Populair

Al snel nadat het apparaat was geïnstalleerd merkte Dennis dat ook andere groepen belangstelling hadden om er mee te werken. “Dat kan ik alleen maar toejuichen. Maar op een gegeven moment hebben we dat wat moeten afstoppen, want de mensen van ons eigen lab kwamen nauwelijks nog aan de beurt. We zijn daarop met een inschrijfsysteem begonnen en hebben dat zo uitgedokterd dat de machine minimaal drie dagen voor ons eigen lab beschikbaar is. Dat werkt goed. Met een vergrotingsfactor x100 kunnen we de cellen prima in beeld krijgen, ook de relatief grote L-vormen. En als het nodig is, kunnen we uitwijken naar een confocal, of zelfs nanoscopie waar we tot op molecuulniveau kunnen kijken. De hele dynamische range is in Leiden voorzien!”

High-throughput imaging

Verreweg de meest gebruikte analysetechniek in Dennis’ onderzoeksgroep is imaging. Dat gebeurt sinds 2019 vooral op het door BioSPX geleverde Lionheart imagingsysteem van Agilent/BioTek. “Een high-throughput microscoop stond al een tijdje op mijn wensenlijst voor het lab. Toen ik in 2019 een Vici-beurs kreeg was het direct duidelijk waar een deel van dat budget naar toe zou gaan. We hebben hier de meest fantastische microscopen, maar die zijn vaak te sophisticated voor wat we in de dagelijkse praktijk nodig hebben. En ze zijn veelal bezet. Dus ik wilde een goede machine hebben, waar we de celbiologie die wij nodig hebben, mee kunnen doen”, vertelt Dennis.

“Dit apparaat is voor ons wel een gamechanger geweest”, vervolgt hij. “We hebben waanzinnige filmpjes kunnen maken, wat we weliswaar ook met een confocal hadden kunnen doen, maar dat zou veel meer tijd hebben gekost. Het geeft ons mogelijkheden om tot 8, 16 of zelfs 96 replicates in één keer te runnen. Soms zoeken we ook naar events die sporadisch voorvallen. Zo hebben we met live cell imaging een prachtig filmpje kunnen maken van de opname van DNA aan de hand van endocytose. Dat gebeurt misschien eens in de 100.000 cellen die je bekijkt. Dat is met de Lionheart te behappen. Je bent wel twee weken verder, maar niet maanden zoals met de confocal. Daarbij is de imaging sterk geautomatiseerd. Het apparaat werkt feilloos. Ondanks het intensieve gebruik hebben we er in al die jaren misschien één keertje iets mee gehad.”

Pac-Man

Vlag uit

Bij de gedachte dat er zich allerhande potentiële bacteriebommetjes in je lichaam zouden kunnen verschuilen, zal niet iedereen de vlag uithangen. Dennis Claessen wel, want hij ziet juist kansen voor effectievere therapieën. “Als we begrijpen hoe het gebeurt, dan hebben we ook de mogelijkheden om het tegen te gaan. Op het moment dat de celwandloze cellen worden gemaakt, zijn ze inherent weinig weerbaar. Dat betekent dat een therapeutische interventie niet superingewikkeld hoeft te zijn. Het is immers veel moeilijker om een bacterie met een celwand kapot te krijgen.”

Inmiddels is er in samenwerking met andere groepen binnen het IBL een project opgestart om te kijken hoe celwandloze bacteriën kunnen worden aangepakt. Er is zelfs al een molecuul gevonden dat specifiek deze cellen bij een hele lage dosis weet te vernietigen, maar daar wil Dennis nog niets over kwijt.

Resistent

De gedaanteverwisseling van de cellen zou ook een rol kunnen spelen in de resistentieproblematiek, die het gevolg is van het toenemende gebruik van antibiotica. Een antibioticum –stressfactor bij uitstek voor een bacterie– grijpt doorgaans aan op de celwand. Een manier om zich hier tegen te beschermen is het verliezen van de celwand, zodat het antibioticum niet langer effectief is. De celwandloze bacterie kan dan onder verder gunstige fysiologische condities in leven blijven. Sterker, zodra de antibioticakuur voorbij is, is de bacterie weer in staat om de celwand terug op te bouwen en je weer ziek te maken.

Een dergelijk mechanisme is aangetoond bij chronische blaasontsteking door onderzoekers van het Institute for Cell and Molecular Biosciences van de Newcastle University, waar Dennis in 2006/7 nog als Marie Curie Fellow onderzoek heeft gedaan en bij hem de interesse ontstond voor celwandloze bacteriën. In de urine van patiënten met steeds terugkerende blaasontsteking blijken bacteriën te zitten die naadloos kunnen schakelen tussen groei met en groei zonder celwand. Na toediening van een antibioticum schakelen ze naar groei zonder celwand. Ze maken je dan vermoedelijk ook niet ziek, maar ze zijn er nog wel. Stopt de kuur na een paar weken, dan gaan ze langzaam weer terug naar de vorm met celwand en kunnen ze je opnieuw ziek maken.

Aanvullend bewijs

De komende jaren willen de Leidse onderzoekers de celwandloze bacteriecellen proberen aan te tonen in klinische monsters van tuberculose-patiënten. Wat Dennis betreft zijn er aanwijzingen zat die daarvoor een gerede slagingskans voorspellen. “Je kunt de dragers van het sluimerende tuberculose-bacterie wel met moleculaire diagnostiek (PCR) detecteren, want het DNA zit er gewoon in. Diagnostiek op basis van kleuring werkt niet, want die grijpt weer aan op bepaalde elementen in de celwand. Ook het verwarmen van de cellen in de diagnostische methode werkt daarin niet mee, want daardoor knappen de cellen en heb je sowieso geen kleuring. Dat zie je ook terug in de praktijk: standaard diagnostiek, die in veel niet-Westerse landen nog als enige wordt toegepast, levert een negatief resultaat, terwijl PCR laat zien dat de betreffende mycobacteriën wel degelijk aanwezig zijn.”

Allemaal bolletjes

De hypothese van Dennis komt niet uit de lucht vallen. Noortje Dannenberg, één van de aio’s binnen de groep, heeft onlangs laten zien dat verschillende mycobacteriën vrij gemakkelijk celwandloze cellen kunnen vormen, dus zonder directe remming of hulp van direct op de celwand aangrijpende stoffen als antibiotica. Dat geldt ook voor een niet-virulente –op het IBL zijn geen faciliteiten om met virulente stammen te mogen werken– tuberculosestam, die wordt gebruikt als model voor virulente tuberculosestammen. Een stressfactor zoals verhoogde osmotische waarde was al voldoende voor deze cellulaire uitkleedpartij.

Een volgende stap is te onderzoeken of dat effect ook te zien is in een meer fysiologische setting. “De experimenten zijn uitgevoerd met geïsoleerde bacteriecellen. De gevormde celwandloze cellen zijn rond; het zijn gewoon bolletjes. Die bolletjes kunnen heel klein, maar ook heel groot zijn. Dat is geen probleem als je ze in isolatie onderzoekt, want dan weet je dat je naar specifiek die cellen zit te kijken. Ga je werken in meer natuurlijke systemen met allerhande gastheercellen, dan zijn er van nature al heel veel andere ronde celvormen aanwezig, en is het dus heel moeilijk om te bepalen of je naar een bacterie zonder celwand zit te kijken of naar een andere structuur. Inmiddels hebben we wel al enkele moleculen die specifiek celwandloze cellen kunnen targetten voor labdoeleinden.”

Niet schrikken, maar er is een gerede kans dat je drager bent van de tuberculosebacterie. Bij naar schatting 1 op de 3 à 4 mensen is dat het geval, en daarvan zal zo’n 10% ook daadwerkelijke TBC krijgen. Enigszins geruststellend voor hier is dan wel weer dat dit vooral in niet-Westerse landen aan de orde is, met overigens wel een grote mortaliteit: ieder jaar sterven er 1,5 miljoen mensen aan de tuberculose-bacterie.

Moleculair microbioloog Dennis Claessen heeft een opmerkelijke verklaring voor het zo gemakkelijk en langdurig overleven van deze mycobacterie in de gastheer. “Het onder de radar blijven voor het immuunsysteem kan wel eens te maken hebben met de vorming van celwandloze cellen. Als deze bacteriën geen celwand hebben, heeft het immuunsysteem ze namelijk minder snel in de smiezen, omdat de herkenningspunten voor de immuuncellen, die zich juist op de celwand bevinden, er niet meer zijn. Sterker, dergelijke celwandloze cellen kunnen zich zelfs in onze immuuncellen verstoppen, als een soort van Trojaans paard!”