Sabrina Delattre, product manager bij Nikon Europe: “Slimme softwaretools bij de Nikon AX/AX R maken het optimaal instellen van de microscoop en de beeldacquisitie een stuk gemakkelijker, zodat ook minder ervaren gebruikers goed uit de voeten kunnen met confocale microscopie.
Confocale microscopie profiteert optimaal van de ontwikkelingen op het gebied van elektronicahardware en kunstmatige intelligentie (AI). Dat komt naar voren in de vorm van prestaties als het sneller grotere hoeveelheden data verzamelen over een groter meetoppervlak met een grotere gevoeligheid. Precies waar gebruikers naar op zoek zijn. Slimme softwaretools maken het optimaal instellen van de microscoop en de beeldacquisitie een stuk gemakkelijker, zodat ook minder ervaren gebruikers goed uit de voeten kunnen met deze techniek. In de Nikon AX/AX R confocale microscopen is wat dat betreft de laatste stand der techniek toegepast.
Snellere imaging van grotere specimens met meer detail
Vrijgeprepareerde muizenhersenen, verkregen met CFI Plan Apochromat Lambda 4x, Galvo 8192x8192. Het ingezoomde gedeelte aan de rechterkant laat zien hoe hoog de resolutie is, zelfs met eenobjectief met lage vergroting.
Met de AI-gebaseerde software hoeft de gebruiker alleen in te voeren welke fluorofoor er wordt gebruikt.
C. Elegans, collageenkleuring met Plan Apo Lambda D 60x olie Galvo 1024x1024, waarbij boven de verbeterde signaal-ruisverhouding met NSPARC is te zien (met dank aan Dr. Yidong Shen Research Group, Center for Excellence in Molecular Cell Science, CAS).
Waar met de modulaire opzet meer gebruikers op maat kunnen worden bediend, zijn er in de bedieningssoftware features ingebouwd die de drempel verlagen om met confocale microscopie aan de slag te gaan. “Voorheen was het best wel lastig om een experiment op te zetten. Je moest behoorlijk ervaren zijn om met de vele opties en parameters uit de voeten te kunnen, zoals de aard van het monster, de fluorofoor die in beeld moet worden gebracht, de gewenste S/N-verhouding, resolutie, enzovoorts. Als iets verkeerd is ingesteld, kan dat leiden tot bijvoorbeeld beschadiging van het monster of een suboptimale resolutie en worden de imagingmogeljkheden van het systeem niet ten volle benut. Met de intelligente software hoeft de gebruiker alleen in te voeren welke fluorofoor er wordt gebruikt. Op basis daarvan zal de software automatisch het optimale verlichtingsschema instellen, waarbij uiteraard rekening wordt gehouden met de hardware-configuratie (laser, detector, ...). Dat geeft, zeker bij minder ervaren gebruikers die de microscoop bijvoorbeeld maar twee uur per maand gebruiken, minder kans op slechte beelden en/of beschadiging van het monster. AI-gebaseerde software kan worden ingezet voor het vergemakkelijken van data-acquisitie, visualisatie en beeldanalyse. En is daarmee ook voor de meer ervaren gebruikers een handige tool. Daarmee wil niet zeggen dat ze aan de software zijn overgeleverd: in de expert modus zijn ze altijd in full control!”
De principes achter confocaal leggen een beperktheid op ten aanzien van de resolutie, die immers niet verder kan gaan dan de diffractielimiet. Daarbij komt ook nog dat je afhankelijk bent van de helderheid van het signaal, het aantal fotonen, dat wordt uitgezonden door de fluoroforen in het monster. Om resolutie te winnen kan je de pinhole verkleinen. Maar dan laat je ook minder licht door, en bereiken minder fotonen de detector, wat ongunstig is voor de S/N-verhouding.
Met een nieuwe detector, de NSPARC, omzeil je de pay-off tussen resolutie en S/N-verhouding en kan je ze tegelijkertijd verbeteren. Deze detector is gebaseerd op Imaging Scanning Microscopy (ISM), een technologie die bijna 30 jaar geleden is ontwikkeld. De puntdetector wordt hierbij ingeruild voor een array-detector, met in dit geval een array van 25 detectoren, in vijf rijen van vijf. Deze verzameling van SPPC’s (Single Pixel Photon Counters) werkt als een uiterst gevoelige camera waarbij de tweedimensionale ruimtelijke informatie van elke gescande pixel door de detector wordt verzameld.
Wervelkolom van een muis, verkregen met Plan Apo Lambda 60x, die met NSPARC (links) een betere resolutie laat zien en meer details van de wervelkolom morfologie prijsgeeft (met dank aan Lin Daniel PhD, SunJin lab Co).
Ten opzichte van de gebruikelijke 18 mm diagonaal is het zichtvlak met een FOV van 25 mm bijna twee keer zo groot.
Zo werkt een confocale microscoop
De confocale microscoop is gebaseerd op hetzelfde principe als bij een optische fluorescentiemicroscoop voor het detecteren van fluoroforen in het monster. Hierbij wordt met laserlicht van een bepaalde golflengte de betreffende fluorofoor in het monster geëxciteerd, die op zijn beurt fluorescerend licht van een andere golflengte uitzendt dat via een filter van de rest van het uitgezonden licht wordt gescheiden.
Bij confocale microscopie wordt laserlicht van een bepaalde golflengte door een dichroïde spiegel gereflecteerd en op een monster gericht. Bij excitatie zendt de flurorofoor fotonen uit die het objectief passeren en de fotomultiplier-detector bereiken. Om te voorkomen dat out-of-focus fotonen de detector bereiken en tot beeldonscherpte leiden, wordt tussen het objectief en de detector een pinhole (kleine opening) aangebracht.
Door het monster of de lichtbundel met hele kleine stapjes te bewegen kan het oppervlak van het monster worden gescand. Op die manier kan een 2D-beeld op een bepaalde hoogte worden gereconstrueerd. Door die exercitie op verschillende hoogtes te herhalen kan een 3D-beeld worden verkregen. Door in time-lapse experimenten de 3D-dynamiek in de tijd te volgen voeg je daar nog een vierde dimensie aan toe.
Meer uitleg over confocale microscopie vind je in dit filmpje
Elke pixel van de array-sensor fungeert als een zeer klein pinhole van slechts 0,2 AU (array-eenheden), waar de pinhole in de conventionele setting 1,0 AU is. De gehele detector-array is echter gelijk aan 5 * 0,2 = 1 AU, waardoor het verzamelde signaal gelijk is qua lichtsterkte; de spatiële informatie wordt behouden, omdat je die van ieder van die pixels verkrijgt. Echter de resolutie van het uit de 25 signalen geconstrueerde beeld is veel beter. Die komt in de orde van 100 nm. Door het bijzonder lage ruisniveau in vergelijking met traditionele GaAsP-detectoren zijn een hoog contrast en scherpe beelden mogelijk.
De detectortechnologie heeft ook positieve impact op de S/N-verhouding en resolutie in de diepte, wat tot betere resultaten leidt bij metingen aan bijvoorbeeld celclusters en weefselcoupes. Met een axiale resolutie van 300 nm zijn gedetailleerde structuren te zien, die anders verloren zouden gaan in de achtergrondruis.
Met een FOV (‘field of view’) met een diagonaal van 25 mm komen de confocale microscopen uit de twee jaar geleden op de markt gebrachte Nikon AX/AX R tegemoet aan de wens naar meer kunnen zien in één beeld. Ten opzichte van de gebruikelijke 18 mm diagonalen is het zichtvlak bijna twee keer zo groot. Daarmee kan bijvoorbeeld de beeldinformatie van de dwarsdoorsnede van een volwassen rattenbrein bij gebruik van een 1x objectief in één keer worden binnengehaald.
“Met een grotere FOV is het natuurlijk ook zaak dat je de pixeldichtheid tenminste handhaaft om de gewenste scanresoluties te halen. Dat is in de AX gerealiseerd met de Galvano scanner, die beelden kan maken met een resolutie van 8192 x 8192 pixels”, vertelt Sabrina Delattre, product manager bij Nikon Europe. “Met een hogere pixeldichtheid zorg je voor beelden met een hoge resolutie, zelfs bij gebruik van objectieven met een lage vergroting.”
Niets zo fijn als je werkt met voor microscopiebegrippen grote onderzoeksmonsters als embryo's, organoïden of sferoïden om die in één beeld te kunnen vangen. Dat voorkomt veel rework. Je hoeft namelijk geen plaatjes samen te voegen tot een groter beeld, wat niet alleen veel tijd kost, maar ook de nodige uitdagingen met zich meebrengt om de overlappende gedeeltes naadloos op elkaar te laten vallen en zichtbare naden te vermijden.
Als referentietechniek voor imaging van biologische monsters heeft het gebruik van gefocust laserlicht bij het punt-voor-punt scannen inherent het gevaar van beschadiging van cellen in zich. Voor meer milde belichtingscondities is er de Resonant scanner. “Deze maakt net als de Galvano scanner gebruik van twee spiegelparen om de laserstraal op het monster te richten. Bij de Galvano blijft de straal relatief lang op een en dezelfde plek gericht, wat als voordeel meer detail oplevert omdat je meer fotonen kan opvangen. Bij de Resonant scanner resoneert één van de twee spiegelparen heel snel, waardoor de laserstraal minder lang op dezelfde plek is, en dus minder celschade kan veroorzaken. Hiermee zijn ook snelle video-opnames (maximaal 720 fps) te realiseren bij een goede resolutie (2048 x 2048). Dat is in combinatie met de grote FOV uniek”, stelt Sabrina.
Gebruikersvriendelijk
Modulair
Met z’n 25-en
Betere resolutie
Snel en mild
Met de spec’s van de NSPARC in gedachten kan je stellen dat iedere gebruiker die wel in zijn of haar confocale systeem zal opnemen. Dat is volgens Sabrina niet het geval. “Een gebruiker kijkt in de eerste plaats naar wat er nodig is. Als dat met een GaAsP-detector lukt, is er niet direct een reden om de NSPARC te gebruiken. Aan de andere kant geloven wij dat gebruikers ook op zoek zijn naar systemen die kunnen evolueren op basis van hun onderzoeksvragen. Instrumenten mogen daarin niet de beperkende factor zijn. Daarom hebben we extra moeite gedaan om de AX zo modulair mogelijk te ontwikkelen. Men kan bijvoorbeeld het type detectorunit, het aantal paden binnen de detector en de typen detectormodules kiezen. Bovendien kunnen later extra modaliteiten worden toegevoegd zoals fotostimulatie, super-res module, en nog veel meer.”