In de SFC-250 is ruimte voor zes kolommen, die eenvoudig via het touch screen op de voorzijde van het apparaat kunnen worden geselecteerd voor de scheiding.

Een extra troef van SFC in het detecteren van impurities is dat het ten opzichte van reversed phase LC de volgorde van de pieken als het ware omdraait. Jesse legt uit: “CO₂ gedraagt zich als een normal phase oplosmiddel en in tegenstelling tot reversed phase LC komt bij normal phase systemen, zoals de SFC, de polaire component later van de kolom dan a-polaire componenten. Dat kan gunstig zijn voor je scheiding wanneer de onzuiverheid die je wilt isoleren bij reversed phase een ‘schouder’ van je hoofdpiek is. Bij SFC komt de onzuiverheid dan juist vaak voor je hoofdpiek te zitten en is dus beter gescheiden van de hoofdpiek. Mede hierdoor zien we meer en meer de toegevoegde waarde van SFC als complementaire techniek voor reversed phase LC-MS.”

Alternatief voor reversed phase

Bij Symeres wordt preparatieve SFC ook ingezet voor het oplossen van analytische vraagstukken bij klanten. “We krijgen steeds vaker de vraag om een onzuiverheid uit een mengsel te isoleren en te identificeren. Dan voeren we met de analytische SFC een screening uit met de verschillende kolommen en co-solvents. Daarna voeren we de scheiding uit met de SFC-250 en kunnen zo de gewenste onzuiverheid isoleren. Dit is nodig voor bijvoorbeeld tox-studies of omdat een bestaand proces wordt aangepast door gebruik van andere grondstoffen of veranderende regelgeving. Onzuiverheden boven een grenswaarde van bijvoorbeeld 0,1% moeten dan worden geïdentificeerd. Om deze kleine hoeveelheden, vaak maar een paar milligram, te isoleren, moeten we soms wel 10 tot 100 gram van een verbinding opzuiveren”, aldus Erik.

Directe klantondersteuning

Die expertise heeft zich sinds 2015 nadrukkelijk ontwikkeld op het gebied van superkritische vloeistofchromatografie (SFC), met de aanschaf van ons eerste analytisch SFC-systeem. “Om een mengsel van enantiomeren te scheiden, voer je in de regel een chirale screening uit om tot de ideale setup van je kolom en loopvloeistof te komen. Aanvankelijk deden we dat voornamelijk met normal phase vloeistofchromatografie. Daar was nogal wat tijd mee gemoeid: zo een uur per run. Als je verschillende mobiele fasen en kolommen wil testen, ben je dus al gauw een dag bezig, voordat je de eerste resultaten hebt. Met de analytische SFC duurt een meting gemiddeld tussen de 2 en 6 minuten, waardoor we snel meerdere scheidingsmethodes kunnen onderzoeken. We hebben vijftien kolommen voor de SFC en we kunnen twaalf verschillende co-solvents toevoegen aan de superkritische CO₂. Standaard nemen we hiervoor methanol, maar ook acetonitril, isopropanol of ethanol worden regelmatig gebruikt. Vaak wordt er nog een zuur of basisch additief toegevoegd om een betere basislijnscheiding en scherpere pieken te krijgen. Al met al hebben we met analytische SFC binnen enkele uren een veel uitgebreider resultaat met veel meer verschillende analytische kolommen dan we met een traditionele screening kunnen krijgen”, legt Jesse uit.

Tijdwinst met SFC

Chirale scheiding van een verbinding binnen 3 minuten. Met 25 stacked injections is zo 480 mg in 1 uur geprept met een resultaat van 99,8-100 e.e.% van beide isomeren (ongeveer 20 mg per run). Zou je dit op normal phase scheiden (met heptaan en bijvoorbeeld ethanol als eluens) dan zou 1 run al snel 20 tot 30 min duren. Bovendien zou naar verwachting maar 10 mg per run kunnen worden opgebracht. Veel tijd- en oplosmiddel-winst dus!

Wat ook ten goede komt aan de snelheid van de Sepiatec SFC is dat circa 90 procent van de preparatieve scheidingen bij Symeres isocratisch gebeurt, dus met een vaste verhouding van de loopvloeistoffen. Het voordeel hiervan is dat je niet hoeft te wachten totdat de run is afgelopen voordat de volgende run gestart kan worden. Duurt die run 10 minuten voor een volledige scheiding, dan kan je bijvoorbeeld om de 2 minuten injecteren. Het systeem is zo opgezet dat het zelf uitrekent wanneer een volgende injectie kan worden gedaan zodat de pieken niet overlappen.

De slimmigheid van het apparaat ervaart Heidi ook in de bediening. “De software is zeer gebruikersvriendelijk, met een touchscreen en eenvoudige menustructuur. Opstarten gaat ook moeiteloos; het apparaat maakt automatisch de leidingen schoon en je kan binnen een kwartier met de zuivering starten. Daarnaast is het systeem zo compact dat het makkelijk op de werkbank past.”

De populariteit van de walk-up systemen wil niet zeggen dat Jesse en haar collega’s het lekker rustig aan kunnen doen. “Integendeel”, lacht Jesse. “Onze chemici maken unieke verbindingen die nog niet onderzocht zijn. We besteden een deel van onze tijd aan het werken aan analytisch uitdagende vraagstukken rond deze unieke verbindingen waarmee we ons als bedrijf kunnen onderscheiden. Eén van onze expertises is het scheiden van enantiomeren, moleculen die elkaars spiegelbeeld zijn en gelijke fysische eigenschappen hebben, maar een totaal andere werking kunnen hebben als medicijn in het lichaam. Hier liggen onze roots, dus daar hebben we een naam in hoog te houden. We zien dat onze ervaring op dit gebied voor veel klanten een reden is om met ons in zee te gaan, niet in de laatste plaats omdat we ook op analytisch vlak wat dat betreft veel expertise in huis hebben.”

“In mijn groep is dat wat minder stringent. Als wij een eindproduct analyseren, wordt er eerst gekeken naar welke techniek (HPLC/GC/SFC) het meest geschikt is voor dit eindproduct. Wij screenen dan op meerdere kolommen met verschillende kolomcondities om zo de zuiverheid te bepalen”, vervolgt zij. “Om te controleren of een reactie goed verloopt, kunnen de chemici ook terecht op één van de walk-up LC-MS/UPLC-MS systemen op hun eigen labs. Daar kunnen ze kiezen uit een drietal generieke methodes, op basis van de polariteit van hun verbinding. Dat ‘quick & dirty’ werk is vooral bedoeld voor intern gebruik, om te controleren of de reactie goed verloopt. Wij onderhouden de systemen en we zijn natuurlijk altijd beschikbaar voor vragen, maar de chemici voeren de analyses zelfstandig uit. Deze werkwijze is zeer succesvol: vorig jaar telden we 60.000 analyses op de walk-up systemen!”

Erik van Echten, die in Groningen als Director Analytical Chemistry leiding geeft aan een team van vijftien analytisch chemici, heeft de opmars van de CRO, en in de slipstream daarvan van de afdeling analytische chemie, bijna vanaf het begin meegemaakt. “In 1988 is Syncom, de voorloper van Symeres, mede opgericht door Hans Wijnberg, leermeester en promotor van ‘onze’ Nobelprijswinnaar Ben Feringa. Toen we in 2000 met onze 30 medewerkers vanuit de universiteit naar de huidige locatie aan de Kadijk verhuisden, is er een analyse-afdeling opgezet, die over de jaren uitgroeide tot het huidige team van vijftien mensen, verdeeld over twee laboratoria. Eén van deze labs, onder leiding van Jesse de Gooijer, is vooral gericht op het analytisch ondersteunen van alle werkzaamheden gericht op de ontwikkeling en synthese van milligram tot kilogram hoeveelheden van nieuwe verbindingen. Het analyse lab van Julie Bolley is nauw verbonden met de ‘process research & development’ groep (PR&D), waar processen worden ontwikkeld die mogelijk richting onze GMP-labs in Weert of Praag gaan.”

Waar bij Jesse op het R&D-lab continu op verschillende chromatografiesystemen samples worden gemeten voor veel verschillende klantprojecten, kan op het lab van Julie een HPLC- of GC-systeem maandenlang voor één klant gereserveerd zijn. “Daar wordt een methode zover uitontwikkeld, dat die in onze GMP-labs volledig kan worden gevalideerd. Hier wordt veel tijd gestopt in het robuust maken van de methode. Al in het beginstadium van het project is het belangrijk om te weten of er tijdens de synthese ongewenste bijproducten ontstaan, en of we die er goed uit kunnen halen. Die moet je dus ook goed kunnen detecteren”, vertelt Jesse.

Gebruiksvriendelijk

Preparatieve SFC

Methode-ontwikkeling

Walk-up systemen

Sterke groei

In het kielzog van de analytische SFC is ook preparatieve SFC aan het Groningse instrumentenpark toegevoegd. “In maart 2022 is door het Berlijnse bedrijf Sepiatec de SFC-250 geïnstalleerd, een compact state-of-the-art systeem waarmee we dingen doen die we met preparatieve LC nooit voor mogelijk hadden gehouden. Zo kunnen we binnen een aantal dagen tientallen grammen van een stof zuiveren, iets wat op de conventionele systemen veel meer tijd zou hebben gekost”, vertelt Jesse.

Preparatieve SFC wordt toegepast voor zowel tussen- als eindproducten, die door de chemici zijn gemaakt. Het gaat dan vaak om lastige zuiveringen die niet lukken met een kristallisatie of bijvoorbeeld flash chromatografie. “De chemici leveren een kolf met hun ruwe materiaal aan”, vertelt Heidi, voor wie de SFC-250 nog maar weinig geheimen heeft. “In de regel kunnen wij 100 tot 500 milligram binnen een uur opzuiveren. Dan heb ik alles gedaan, van de injectie tot het spoelen van het systeem. Grotere hoeveelheden kosten uiteraard meer tijd, want daar zijn meerdere runs voor nodig. Het systeem is zeer flexibel en de chromatografie is uiterst reproduceerbaar. Als ik vandaag een run draai, en ik zet hem morgen weer aan, dan zijn de resultaten gelijk. Zelfs bij 100 runs zijn de pieken niet verschoven. Je vangt ze steeds zuiver op.”

Er lijkt maar geen einde te komen aan de groei van Symeres, inmiddels de grootste CRO van Europa, met meer dan 600 medewerkers op zes locaties in Europa en twee in de Verenigde Staten. Op hun locatie in Groningen werken nu ongeveer 170 mensen en wordt er druk gewerkt om nog efficiënter gebruik te kunnen maken van de beschikbare labruimtes. Daarnaast is er –anticiperend op verdere groei in opdrachten- een continue zoektocht naar meer labruimte en personeel om het groeiende klantenbestand te kunnen faciliteren.