Maak een virtual tour door de pilot plant

Eind vorig jaar heeft NIZO geïnvesteerd in vier Synergy H1 multi-mode readers van Agilent-Biotek, waarvan er hier drie te zien zijn. Uniformiteit binnen de apparaten vergemakkelijkt de inzet in verschillende labs.

De laatste stap in de opschaling, voordat de fermentatie naar de 4500 liter reactor kan worden overgedragen, vindt plaats in dit 600 liter reactorvat.

Weinig omkijken naar

Naast de vier nieuwe door BioSPX geleverde readers worden bij de afdeling microbiologie meerdere oudere types van de Agilent-Biotek readers gebruikt. Patrick: “Voor ons is het essentieel dat ze betrouwbaar hun werk doen, en precies doen wat ze moeten doen. Aan de hand van de intuïtieve bedieningssoftware kan je dat duidelijk aangeven, waarbij er ook nog veel opties zijn om een protocol naar eigen wens in te richten. We hebben in principe standaard instellingen voor de golflengte waarbij we meten. Maar omdat we voor een grote diversiteit aan klanten onderzoek doen willen we wel de flexibiliteit hebben om dat aan te passen. Als je een bepaald enzym moet meten bij een bepaalde golflengte, dan wil je dat ook kunnen. Of als je een nieuwe techniek hebt waarvoor je een in een ander pH-bereik moet meten, met wellicht een andere pH-indicator. Het vrij instelbare bereik geeft ons ook op dat gebied de vereiste flexibiliteit.”

Die flexibiliteit is ook een uitkomst voor de experimenten met zogenaamde sporenvormende bacteriën, die vanwege de besmettelijkheid ook in een aparte labruimte moeten worden uitgevoerd. “Sporenvormende bacteriën zijn heel resistent. Als een bacterie een spore maakt, kapselt hij zichzelf in en kan je hem niet makkelijk afdoden met hitte. Dus de spore overleeft vaak de pasteurisatie, waardoor die toch in je product blijft zitten. Als je product later op het schap staat en de omstandigheden zijn gunstiger, dan komt ie weer tot leven en besmet alsnog je product. Die sporenvormers onderzoeken we veelal in het kader van voedselveiligheid. Omdat ze in vergelijking met andere bacteriestammen vaak bij hogere temperaturen groeien, voeren we incubatie-experimenten uit bij temperaturen van rond de 65 °C. Daarbij komt de Synergy H1 goed van pas, want die kan wat dat betreft tot 70 °C.”

Sporenvormers

De eiwittransitie is in volle gang, en dat merken ze bij NIZO. “Veel bedrijven willen af van dierlijke eiwitten en daarvoor in de plaats plantaardige eiwitten gebruiken. Maar als je bijvoorbeeld een kaas wil maken van planteiwitten, dan kan je niet zomaar de processen die zo goed voor melk werken toepassen op die nieuwe eiwitbron. De processen zijn dan vaak minder efficiënt of ze werken helemaal niet, omdat de bacteriën andere structuren en suikers krijgen voorgeschoteld dan ze gewend zijn. Ook kunnen er ongewenste bijsmaken ontstaan, zoals de ‘bonensmaak’ van eiwitten op basis van peulvruchten, die wordt veroorzaakt door vluchtige stoffen als hexanal. Of er zitten componenten in die je er niet in wil hebben, zoals verbindingen die de verteerbaarheid van eiwitten of de biologische beschikbaarheid van aminozuren kunnen verminderen. Wat daarbij extra uitdagend is dat de diversiteit aan plantaardige eiwitten veel groter is dan die van de dierlijke; en ieder plantaardig eiwit zich weer op zijn eigen manier gedraagt”, vertelt Patrick Janssen, scientist Fermentation bij NIZO.

Zowel de absorptie als de fluorescentie wordt uitgelezen op microplaatreaders, in het geval van NIZO de multi-mode readers van Agilent-Biotek. “Eind vorig jaar hebben we vier Synergy H1 readers aangeschaft om zoveel mogelijk uniformiteit te krijgen binnen de apparaten. Hierdoor hebben we bij het draaien van projecten meerdere opties. We hebben bijvoorbeeld labs waar we werken met genetisch gemodificeerde organismen; andere labs zijn uitgerust voor foodgrade organismen. Het is vanwege kwaliteit en efficiëntie wenselijk om niet met readers tussen deze labs te hoeven slepen. Soms hebben we incubaties van drie weken; dan moet je niet hoeven wachten totdat dat experiment is afgesloten voordat je met een nieuwe kunt beginnen. En ook heel praktisch: als je verschillende experimenten tegelijk wilt runnen bij verschillende temperaturen, dan heb je ook meerdere apparaten tegelijk in gebruik. Met vier apparaten, die exact op dezelfde manier werken, heb je optimale flexibiliteit en de benodigde capaciteit. Ook kunnen we eenvoudig protocollen delen tussen de verschillende readers”, aldus Patrick.

Door de bank genomen zijn er twee basisvarianten voor de testopzet. Een klant heeft een product en je onderzoekt wat je daar in het kader van de vraagstelling het beste mee kunt doen. Dan ga je dus kijken welke bacteriën hiervoor het meest geschikt zijn; de beste groei vertonen. In de welletjes van de microtiterplaat zit dan hetzelfde substraat, waarop een hele rits aan bacteriestammen wordt losgelaten. Bij de tweede basisvariant heeft het bedrijf al een bacteriestam en is de opdracht om die beter te laten groeien. Dat is bijvoorbeeld aan de orde als het bedrijf een volledig plantgebaseerd medium wil toepassen. Door te variëren in concentraties van grondstoffen en toevoegingen als vitamines kom je tot de beste groeimix voor de betreffende bacterie.
Voor de eerste testen op microplaatniveau is er keuze tussen het gebruik van een 96- of een 384-wells plaat. “Voor de vertaalslag naar de verdere opschaling geven wij de voorkeur aan 96-wells, zeker bij bacteriën die veel zuurstof nodig hebben. Deze welletjes hebben namelijk een groter contactoppervlak met de lucht. Bovendien geeft de ronde, niet al te diepe vorm bij schudden een betere dynamiek dan bij de kleinere welletjes. Maar in het geval dat we veel verschillende bacteriestammen willen screenen is een 384-wells testopzet wel een stuk efficiënter. Dat geldt ook voor experimenten waarbij we bijvoorbeeld een drievoudige meting op dezelfde plaat willen doen”, legt Patrick uit.

Projecten verschillen ook in omvang. Waar je voor het ene project genoeg hebt aan een paar platen, zijn er andere opdrachten waar je een veelvoud aan microtiterplaten nodig hebt. In dat laatste geval vindt de screening vaak in meerdere cycli plaats: eerst globaal testen met welke soorten bacteriën of onder welke omstandigheden je in de goede richting zit, en in een volgende stap finetunen.

De verscheidenheid aan opdrachten maakt ook dat de testcondities sterk van elkaar kunnen verschillen, bijvoorbeeld qua temperatuur of al dan niet onder anaërobe omstandigheden. Ook worden er experimenten uitgevoerd met incubaties van wel drie weken, de zogenaamde ‘long term” incubaties.

Om voor het produceren van een bepaald product de optimale combinatie te vinden tussen bacterie en procescondities kan NIZO putten uit een wereldwijd gezien best wel unieke, nog steeds uitdijende collectie van meer dan 4.000 verschillende bacteriestammen. Naast de historische basis van bacteriën, die in de zuivelindustrie worden toegepast, zijn dat steeds meer bacteriën uit plantisolaten, alsmede probiotica, zowel de zuivelvarianten als die uit humane isolaten.

In high-troughput experimenten wordt een grote verscheidenheid aan bacteriestammen uit die collectie gescreend op hun werkzaamheid bij verschillende mediasamenstellingen. “We halen ze door een figuurlijke trechter. We beginnen heel breed, met veel stammen of met veel substraten. In een eerste screening op microtiterplaatniveau selecteren we de beste kandidaten. Daarmee gaan we opschalen naar eerst een halve liter en dan via 30 en 600 liter tot uiteindelijk 4500 liter op pilot plant niveau in de proeffabriek, waar we op foodgrade niveau kunnen produceren. In die sequentie ga je steeds verder selecteren en ook optimaliseren, want de dynamiek in een welletje in een microtiterplaat is nogal verschillend met die in de verschillende reactoren. Bovendien kan je in de reactoren meer regelen, de pH constant houden, beter roeren, onder bepaalde gassen werken, noem maar op. Uiteindelijk maak je een zo robuust mogelijk proces, dat je ook steeds beter kunt monitoren. Bij dit alles zit ook een stuk downstream processing, waarbij je uitzoekt hoe je vanuit het fermentatieproduct tot een poeder met de bacteriën komt, dat de klant kan gebruiken in zijn toepassing. Hiervoor hebben we faciliteiten voor vriesdrogen en sproeidrogen”, aldus Patrick.

Naast de eiwittransitie is de opkomst van probiotica een belangrijke driver voor het contractonderzoek dat door NIZO wordt uitgevoerd. “Veel klanten in de farmahoek werken aan probiotica. Daar is een verschuiving gaande van de klassieke probiotica, die afkomstig zijn uit gefermenteerde producten als yoghurt en kaas (zeg maar de melkzuurbacteriën), naar humane isolaten uit met name de darm. Die groeien onder andere omstandigheden en kunnen vaak niet tegen zuurstof. Dat betekent dat je je onderzoek onder anaërobe omstandigheden moet uitvoeren. Hiervoor hebben we opstellingen geconfigureerd in speciale kasten, waar onder zuurstofloze condities kan worden gewerkt. Insteek van het onderzoek aan probiotica is veelal het vinden van een proces om ze zo efficiënt mogelijk te produceren.”

Uniformiteit in readers

Kijken naar de groei

Flexibele testopzet

Door de trechter

Probiotica

Bakens in die verscheidenheid van de testconfiguraties zijn de parameters die bij de screening worden gehanteerd voor het beoordelen van de bacteriegroei. Dat zijn steevast de optische dichtheid (OD) en de verzuring. De OD wordt bepaald op basis van absorptie; de pH-verzuringscurve wordt met hulp van fluorescente probes bepaald aan de hand van fluorescentiemetingen. “Met dichtheid alleen kom je er vaak niet, want eiwitsubstraten zijn vaak niet doorzichtig. Als je de pH volgt, heb je toch een maat voor de activiteit. Daarbij passen we natuurlijk ook allerlei enzymatische assays toe op microtiterplaatniveau om de vorming c.q. afbraak van een bepaald eiwit of enzym te kunnen volgen.”